扩展性无创产前检测在胎儿染色体异常筛查中的应用

吕 虹，吴玥丽，刘 灵，崔世红，李 莹，田伟芳，殷贵霞，麻雪利

郑州大学第三附属医院产前诊断中心 郑州 450002

2012年统计我国出生缺陷发生率约为5.6%[1]。遗传因素是导致出生缺陷的重要因素之一。在遗传因素中，染色体异常占80%以上[2]，包括染色体非整倍体和拷贝数变异(copy number variant，CNV)；CNV一般指长度为1 000 bp以上的基因组大片段缺失和重复[3]。随着孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现，无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)因操作简便、无创、准确性高及孕周范围广等优势逐渐成为产前筛查的主流技术[4]，已广泛用于胎儿21-三体、18-三体和13-三体的产前检测，并可辅助报告其他染色体异常，如性染色体非整倍体(sex chromosomal aneuploidy，SCA) 和部分CNV[5]。近年来，随着测序技术的不断发展，扩展性无创产前检测(non-invasive prenatal testing plus，NIPT-plus)逐步应用于临床，NIPT-plus增加了测序深度、扩大了检测范围，可报告部分染色体CNV。本研究对比了NIPT-plus与NIPT对胎儿染色体异常的筛查结果，着重分析NIPT-plus的检测效能。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019年5月至12月在郑州大学第三附属医院产前诊断中心就诊且进行NIPT或NIPT-plus检测的9 136例孕妇为研究对象，根据选择项目分为NIPT组6 110例及NIPT-plus组3 026例。纳入标准：年龄≥18岁；单胎妊娠；签署知情同意书。排除标准：孕妇染色体异常；合并恶性肿瘤；4周内接受过免疫治疗；1 a内接受过异体输血、移植手术或异体细胞治疗。

1.2 NIPT及NIPT-plusNIPT具体步骤如下。①样本采集和游离DNA提取：使用Streck Cell-Free DNA BCT采血管收集7～10 mL孕妇外周血，18～25 ℃保存，72 h内分离血浆。取200～600 μL血浆，使用游离DNA提取试剂盒(磁珠法)提取、纯化胎儿游离DNA，并建立标准质量控制系统。②DNA文库构建及定量：采用无创胎儿染色体非整倍体(T13/T18/T21)检测试剂盒(测序法)及高通量测序文库构建DNA纯化试剂盒(磁珠法)处理上述步骤中提取的DNA，对其进行末端修复、补平、接头连接、缺口修复、纯化，构建样本DNA文库。文库构建成功后，进行荧光定量PCR(qPCR)，分析qPCR数据，判断可信度，如数据偏差太大，需重新定量，如数据可信，记录文库浓度，文库浓度≥10 pmol/L为合格文库，否则需重新建库。③测序模板制备：将DNA文库稀释、混合，即为混合文库。使用 Ion One Touch 2仪扩增混合文库，制备测序模板，使用Ion One Touch ES系统富集模板序列。④测序及数据分析：采用NextSeq CN500高通量测序仪对所有样本进行低深度(0.035×)测序，要求每例样本的有效数据量大于3 000 000，胎儿游离DNA浓度最低标准为4%，所有入组样本质控均合格。将测序仪检测生成的样本序列与模板序列进行比对，将比对结果可视化，分析测序结果。在本研究中，Z值介于-3～+3判断为低风险，<-3或>+3判断为高风险。⑤质控：每次检测中应至少加入一对阴阳性质控品，用于监控测序结果是否真实有效。

NIPT-plus采用NextSeq CN500高通量测序仪对所有样本进行低深度(0.175×)测序，要求每例样本的有效数据量大于15 000 000，胎儿游离DNA浓度最低标准为8%，所有入组样本质控均合格。余步骤同上。

检出率为高风险孕妇人数/检测人数×100%。

1.3 胎儿细胞低深度全基因组测序(copy number variation sequencing，CNV-seq)及染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)NIPT-plus或NIPT检测提示高风险孕妇265例，其中248例接受羊膜腔穿刺术取羊水细胞行CNV-seq或CMA。CNV-seq参照NEXT seq CN500平台测序试剂盒说明操作，采用Burrows-Wheeler算法将测序序列与hg19基因组进行比对，通过生物信息学分析，判断样本是否存在SCA及CNV。CMA应用美国Affymetrix公司单核苷酸多态性微阵列检测平台，运用3.3版ChAS软件进行数据分析。

数据分析：通过OMIM、UCSC、International Standard Cytogenomic Array(ISCA)、Database of Genome Variants(DGV)、Decipher 等数据库对CNV-seq或CMA检出的CNV进行分类和验证，将CNV分为5类(致病性、可能致病性、不确定意义性、可能良性和良性[6])。对于不确定意义性CNV，进一步对亲本进行CNV-seq或CMA验证[7]。

1.4 统计学处理采用SPSS 26.0处理数据。采用χ2检验比较NIPT组与NIPT-plus组胎儿21-三体、18-三体、13-三体及其他染色体异常检出率及阳性预测值的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 研究人群的基线特征见表1。NIPT组中82.6%的孕妇由于存在高危因素选择NIPT，NIPT-plus组74.2%的孕妇存在高危因素选择NIPT-plus(部分具备产前诊断指征的孕妇在已充分告知相关风险后，因个人原因拒绝产前诊断，要求进行NIPT或NIPT-plus)；其他入组孕妇因未进行唐氏筛查或因自愿等情况要求进行NIPT或NIPT-plus。

2.2 两组染色体异常检出率的比较两组21-三体、18-三体、13-三体检出率差异无统计学意义，但NIPT-plus组CNV检出率更高(表2)。

2.3 两种方法检测染色体异常的阳性预测值比较两种方法检测21-三体、18-三体、13-三体、SCA及CNV的阳性预测值差异均无统计学意义，见表3。两种方法检测SCA中XO、XXX、XXY、XYY类型的阳性预测值差异无统计学意义，见表4。

表1 两组孕妇的基本情况 例(%)

续表1 例(%)

表2 两组染色体异常检出率比较 例(%)

表3 两组验证结果的比较

表4 两组不同类型SCA验证结果的比较

3 讨论

染色体异常包括染色体非整倍体和CNV。常见的染色体非整倍体有21-三体、18-三体、13-三体和SCA。本研究旨在分析与NIPT相比，NIPT-plus筛查胎儿染色体异常的效能。

本研究中，经羊水穿刺产前诊断(CNV-seq或CMA)结果验证，NIPT与NIPT-plus检测所有染色体异常的阳性预测值差异无统计学意义。NIPT检测21-三体、18-三体的阳性预测值为90.24%、82.14%，NIPT-plus为93.33%、83.33%，两种方法均有较高的诊断效能，且两种方法的检测效能差异无统计学意义。NIPT检测13-三体的阳性预测值为14.29%，NIPT-plus为0.00%，两者阳性预测值均较低，可能由于该疾病发病率较低，实验数据较少。

有文献[8]报道NIPT检测SCA的阳性预测值为62.9%，本研究结果为26.23%，与该文献报道相差较大，可能是由于45，XO、ChrX+、ChrY+类型的SCA占比大，降低了SCA整体的阳性预测值[9]。此外，45，XO类型胎儿可有特异性超声表现，NIPT及NIPT-plus结合超声结果可提高SCA的阳性预测值。值得注意的是，NIPT-plus与NIPT比较，45，XO、47，XXX、47，XXY、47，XYY类型SCA的阳性预测值差异无统计学意义。NIPT-plus报告当中未见ChrX+、ChrY+这2种类型，NIPT-plus是否能够排除此类异常的假阳性有待进一步验证。

根据既往研究结果，NIPT与NIPT-plus对CNV的阳性预测值均较低。Liang等[10]的研究中NIPT-plus对CNV的阳性预测值为40.8%，代鹏等[11]的研究中为26.9%，Zhu等[12]的研究中为33.3%；在Gou等[13]的研究中，NIPT对CNV的阳性预测值为23.1%，在Schwartz等[14]的研究中为8.9%。本研究结果显示NIPT与NIPT-plus对CNV的阳性预测值分别为33.33%和32.26%。胎儿游离DNA片段浓度、CNV大小及测序覆盖范围和深度均会影响检测的准确性[15]。胎儿游离 DNA片段浓度越高，越容易检测到CNV； 较大片段的CNV更容易被检测到，目前已经使用了多种算法和目标捕获富集方法来改进对较小片段CNV的检测准确性[16]；覆盖率越高，可检测到的CNV越小[17]，更深的测序可以提高准确性，但会显著增加成本[18]。另外母体CNV也会影响胎儿游离DNA的检测结果，因此测序深度和生物信息学分析方法有待进一步优化。本研究中NIPT-plus和NIPT对CNV的阳性预测值差异无统计学意义，但NIPT-plus较NIPT具有更高的检出率(1.12%vs0.61%)，推测由于NIPT-plus增加了上机测序样本量，提高了测序数据量和优化算法，因此能够筛查出更多的CNV。

本研究有一定的局限性。NIPT及NIPT-plus检测的并非同一群体，这限制了进一步的分析。 此外，我们的结果需要在更大的样本量中进行验证。另外，有研究[19]发现BGIS00平台的有效数据量高于DA8600平台。本实验检测平台为NEXT seq CN500平台。不同测序平台间质控参数不同，测序平台的差异也可能是研究结果不完全一致的原因之一。

综上所述，NIPT-plus与NIPT检测胎儿染色体异常的效能相近，其中对21-三体、18-三体的阳性预测值较高，具有较高的临床应用价值。在临床上需要结合患者指征、其他检查结果、经济、需求等综合考虑，选择合适的检测方法。随着高通量测序技术的进一步发展和成本的降低，未来NIPT-plus可能为产前筛查提供更高效能的检测。