中草药提取复合物对乳鸽肠道微生物、生产性能和免疫器官指数的影响

2022-12-05陈志炫陈蕙如陈丹心林友钧

福建农业学报 2022年8期

陈志炫，陈蕙如，陈丹心，林友钧

（1.泉州市农业科学研究所，福建泉州 362212；2.泉州市本草赋医药科技有限公司，福建泉州 362104）

0 引言

【研究意义】从2020年7月1日起，我国全面禁止了含有促生长类药物（除中药类外）的饲料添加剂，因此寻找有效的替代抗生素的产品成为科研人员的重点研究方向。中草药的应用在我国有着悠久的历史，从中草药中寻找替代抗生素的产品成为研究热点[1]。【前人研究进展】桃金娘是中国南方地区民间传统常用中草药，以“通经活血，收敛止血”的功效收载于《兽药国家标准（化学药品、中药卷）第一册》中，但对于桃金娘在畜禽养殖中的应用研究处于初始阶段，尤其是兽药新产品的开发与应用尚未起步[2]。有研究表明，桃金娘烯醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌有很好的抑制作用[2-3]，但将其作为饲料添加剂应用于畜禽中却少有报道。三辛酸甘油酯[4-5]、薄荷醇[6-8]和樟脑[9-10]，这三者也都具有很好的抗菌活性，并在猪、鸡、日本鹌鹑等畜禽的应用上显示出对提高饲料利用率和生长性能以及改善肠道菌群具有一定的效果。【本研究切入点】和桃金娘烯醇一样，肉豆蔻酸异丙酯也具有很好的抗菌活性[11]，但却少有报道将肉豆蔻酸异丙酯作为饲料添加剂应用于畜禽中。在已有报道的关于替代抗生素产品的研究中，大多是以鸡、鸭、猪等畜禽作为实验动物[1,12-13]，而较少以鸽子作为试验动物的报道。在前期研究中，根据中药方剂“君臣佐使”的配伍理论，我们提取了以桃金娘为主药，配以薄荷、没药等中草药的有效成分。通过体外抑菌试验确定所筛选出的中草药复方提取物的抑菌效果，接着对有良好抑菌效果的中草药复方提取物进行GC-MS分析化合物组成，最后确定了一个以三辛酸甘油酯、桃金娘烯醇、肉豆蔻酸异丙酯、薄荷醇和樟脑为主要成分的复合物（命名为复合物T）。复合物T作为一个替代抗生素的新产品还需要通过体内外的试验来进一步验证。【拟解决的关键问题】利用乳鸽为晚成雏需要亲鸽子哺育的特性，以10日龄白卡奴乳鸽作为试验动物，通过人工灌喂的方式进行喂养至30日龄，以期为替代抗生素产品的研究工作提供新的试验动物模型。同时，通过进一步的体外抑菌试验和应用于乳鸽的养殖试验，以验证复合物T作为替代抗生素备选产品的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复合物T的组成成分为三辛酸甘油酯11%、桃金娘烯醇3.5%、肉豆蔻酸异丙酯11%、薄荷醇8%、樟脑6.5%，酒精为介质，占60%。其中，三辛酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、薄荷醇和樟脑均购自上海麦克林生化科技有限公司，桃金娘烯醇购自上海源叶生物科技有限公司，酒精购自西陇科学股份有限公司。大肠杆菌（Escherchia coli）菌种编号为ATCC8739，购自上海鲁微科技有限公司。

1.2 不同用量复合物T对大肠杆菌抑制率的测定

采用液体培养基抑制测定法，将培养好的大肠杆菌菌液10 μL和LB液体培养基180 μL加入96孔板的试验孔中，置于TECAN Infinite 200 PRO多功能酶标仪中进行37 ℃孵育培养，在OD600达到0.5时，分别加入10 μL的体积分数分别为20.000 0%，10.000 0%，5.000 0%，2.500 0%，1.250 0%，0.625 0%，0.312 5%，0.156 3%的复合物T和质量浓度为2 000 mg·L-1，1 000 mg·L-1的氨苄西林溶液。试验组复合物T的体积分数以二倍稀释法，分别为1.000 0%，0.500 0%，0.250 0%，0.125 0%，0.062 5%，0.031 3%，0.015 6%和0.007 8%，各试验组分别记为C1、C1/2、C1/4、C1/8、C1/16、C1/32、C1/64、C1/128；阳性对照组氨苄西林质量浓度则为 100 mg·L-1，50 mg·L-1，分别记为AMP100，AMP50。同时设定一组无添加的阴性对照组。每组8个重复。在添加复合物T或氨苄西林后的1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h分别测定OD600，并计算抑制率及12 h和24 h的半抑制浓度（IC50）。

试验组抑制率/%=（1-试验组OD600值/阴性对照组OD600平均值）×100；

阳性对照组抑制率/%=（1-阳性对照组OD600值/阴性对照组OD600平均值）×100

1.3 乳鸽养殖试验设计

随机选取健康、体重均匀的，由亲鸽哺育至10日龄的白卡奴乳鸽180只，称取每只乳鸽的体重（BW），保证各处理初始体重无显著差异(P＞0.05) ，乳鸽采购自福建集盛鸽业股份有限公司。将乳鸽随机分为 3 组，每组 5 个重复，每个重复 12只乳鸽。其中处理1为对照组（CT组），饲喂基础饲粮；处理2为试验T1组，饲喂基础饲粮添加313 mg·kg-1复合物T；处理3为试验T2组，饲喂基础饲粮添加625 mg·kg-1复合物T。基础饲粮为参照NRC（1994）营养需要配制的粉状配合饲料，其组成及营养水平见表1。所有乳鸽采用人工灌喂的方式进行饲喂，饲养至30日龄，灌喂前先将饲料与水按1∶2的比例混合成粥样，人工灌喂养殖标准见表2。饲养过程中，确保乳鸽可自由饮水，并保证鸽舍通风良好，光照、温度和湿度按种鸽养殖标准进行操作。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Nutritional composition of basal diet (air-dry basis)%

表2 试验乳鸽人工灌喂养殖标准Table 2 Standard for introgastric oral feeding squabs

1.4 检测指标和方法

1.4.1 肠道微生物的测定第30日龄，每个重复分别采集新鲜粪便，参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》进行肠道微生物菌群的培养和菌落总数的测定。其中，大肠杆菌用麦康凯培养基进行37 ℃有氧培养，双歧杆菌和乳酸菌分别用TPY培养基和MRS培养基进行37 ℃厌氧培养。麦康凯培养基和MRS培养基均采购自广东环凯微生物科技有限公司，TPY培养基采购自北京陆桥技术股份有限公司。数据结果以lgCFU·g-1为单位。

1.4.2 生长性能的测定第30日龄时，空腹12 h后逐只称取各乳鸽的体重，计算乳鸽试验期间所增长的体重，再结合乳鸽灌喂养殖标准计算平均日增重和料重比。同时，记录每天乳鸽的死亡数，计算存活率。

1.4.3 免疫器官指数的测定第30日龄，每重复随机抽取 3只体重相近的乳鸽进行屠宰，分别取脾脏、胸腺、法氏囊，并剔除附着的组织用滤纸吸干血水后称鲜重，并参照高玉云等[14]的方法计算免疫器官指数。

1.4.4 屠宰性能的测定根据NY/T 823—2020《家禽生产性能名词术语和度量计算方法》规定的方法，测定屠宰率、半净膛率、全净膛率、腹脂率、胸肌率、腿肌率。

1.4.5 肉品质的测定根据NY/T 2793—2015《肉的食用品质客观评价方法》规定的方法测定左侧胸肌 45 min 的pH（pH45min）和 24 h的pH（pH24h）、失水率和剪切力，其中，失水率采用蒸煮损失来衡量。测定仪器为德国DOSTMANN PH5肉类食品酸度计和C-LM 3B数显式肌肉嫩度仪。

1.4.6 血清生化指标的测定在屠宰前，用真空采血管进行翅静脉采血5 mL，倾斜静置，待血清渗出后，-4 ℃ 和 3 000 r·min-1条件下离心 15 min，取上清液，分装于EP 管中，置于-80 ℃ 冻存。谷草转氨酶活性和尿酸含量的测定采用购自北京盒子生工科技有限公司的试剂盒，血清肌酐含量和尿素氮含量的测定采用购自上海晶抗生物工程有限公司的试剂盒，测定仪器为瑞士TECAN Infinite 200 PRO多功能酶标仪。

1.5 数据分析

试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS 9.2统计软件中的ANOVA过程进行单因子方差分析，使用 Duncan 氏法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同用量复合物T对大肠杆菌的抑制率

如表3所示，体积分数为1.000 0%、0.500 0%、0.250 0%、0.125 0%和0.062 5%的复合物T对大肠杆菌的抑制率均显著高于其他各组；从体积分数为0.062 5%开始，复合物T对大肠杆菌的抑制率随着体积分数的减少而显著下降；在12 h，体积分数为0.062 5%及以上的复合物T与AMP100对大肠杆菌的抑制率均没有显著性差异（P＞0.05），并且均显著高于AMP50（P＜0.05）；在 24 h，除了体积分数 0.015 6% 和0.007 8%，其他体积分数的复合物T对大肠杆菌的抑制率都显著高于两个抗生素对照组（P＜0.05）。

表3 不同用量复合物T对大肠杆菌的抑制率Table 3 Inhibition on E.coli by Compound T in different concentrations %

在12 h和24 h，复合物T对大肠杆菌的IC50的计算值分别为0.063 2%和0.042 6%。根据上述结果，在后续的乳鸽养殖试验中，选择体积分数为0.062 5%和0.031 3%的复合物T作为两个试验因子。

2.2 复合物T对乳鸽肠道微生物的影响

如表4所示，对于大肠杆菌，T1组和T2组两个试验组的均值均小于对照组，但各组之间无显著性差异（P＞0.05）；对于双歧杆菌，T2组显著高于CT组和T1组（P＜0.05），而CT组和T1组之间无显著性差异（P＞0.05）；对于乳酸菌，T2组显著高于CT组（P＜0.05），而T1组与CT组之间无显著性差异（P＞0.05）。

表4 复合物T对乳鸽肠道微生物的影响Table 4 Effect of Compound T on gut microflora of squabs lgCFU·g-1

2.3 复合物T对乳鸽生长性能的影响

如表5所示，各组之间的10日龄体重均无显著性差异（P＞0.05），达到了对试验样本选择的要求；T2组的30日龄体重显著高于CT组（P＜0.05），而T1组与CT组之间无显著差异（P＞0.05）；T2组的平均日增重显著高于CT组（P＜0.05），而T1组与CT组之间无显著差异（P＞0.05）；T2组的料重比显著低于CT组（P＜0.05），而T1组与CT组之间无显著差异（P＞0.05）；各组之间存活率无显著差异（P＞0.05）。

表5 复合物T对乳鸽生长性能的影响Table 5 Effect of Compound T on growth of squabs

2.4 复合物T对乳鸽免疫器官指数的影响

如表6所示，T2组的法氏囊指数显著高于CT组（P＜0.05），而T1组与CT组之间没有显著差异（P＞0.05）；对于脾脏指数和胸腺指数，T2组的均值最大，但各组之间都没有显著性差异（P＞0.05）。

表6 复合物T对乳鸽免疫器官指数的影响Table 6 Effect of Compound T on immune organ indices of squabs ‰

2.5 复合物T对乳鸽屠宰性能的影响

如表7所示，总体上，相对于CT组，T1组和T2组的屠宰性能较好；其中，T2组的胸肌率显著高于CT组（P＜0.05），T1组的胸肌率也高于CT组，但两者之间无显著差异（P＞0.05）；对于屠宰率、半净膛率、全净膛率、腹脂率和腿肌率，各组之间均无显著差异（P＞0.05）。

表7 复合物T对乳鸽屠宰性能的影响Table 7 Effect of Compound T on slaughter performance of squabs %

2.6 复合物T对乳鸽肉品质的影响

如表8所示，对于pH45min和pH24h，各组的均值都较为接近，无显著差异（P＞0.05）；T1组失水率的均值最大，但各组之间均无显著性差异（P＞0.05）；T1组剪切力的均值最小，但各组之间均无显著性差异（P＞0.05）。

表8 复合物T对乳鸽胸肌肉品质的影响Table 8 Effect of Compound T on breast meat quality of squabs

2.7 复合物T对乳鸽血清生化指标的影响

如表9所示，T2组谷草转氨酶的均值最大，但各组之间均无显著差异（P＞0.05）；T2组的血清肌酐均值最小，但各组之间均无显著差异（P＞0.05）；T1组尿素氮的均值最大，但各组之间均无显著差异（P＞0.05）；各组尿酸的均值相近，并且都无显著差异（P＞0.05）。

表9 复合物T对乳鸽血清生化指标的影响Table 9 Effect of Compound T on serum biochemical indices of squabs

3 讨论

3.1 人工灌喂乳鸽作为试验动物的效果

乳鸽在孵出后发育还不充分，绒羽稀疏，眼睛未睁开，因此，在自然条件下，乳鸽出壳后需要在亲鸽的保护下，通过喂饲由嗉囊腺分泌的主要含蛋白质和脂肪的鸽乳使其睁眼、丰羽并充分发育[15]。这一哺育过程大约需要30 d。鸽乳开始为乳糜状，随着时间的推进，亲鸽初步消化的饲料占鸽乳的比例越来越高，从9 d开始就基本为经嗉囊浸润的半消化饲料和消化液的混合物[15]，25 d后亲鸽吐喂减少，逼迫乳鸽自行采食。本试验通过模拟亲鸽哺喂的过程，将10日龄白卡奴乳鸽通过人工灌喂的方式喂养至30日龄，试验乳鸽的采食可以被精确地控制，试验过程和相关数据采集达到良好的预期效果。

3.2 复合物T对微生物的影响

根据前期的研究基础，我们筛选了一个以三辛酸甘油酯、桃金娘烯醇、肉豆蔻酸异丙酯、薄荷醇和樟脑为主要成分的复合物T作为替代抗生素的备选产品。其中，三辛酸甘油酯常作为乳化剂和载体应用于医药当中[16]，将其应用到青年猪上可改变肠道菌群[4]。桃金娘烯醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌具有抑制作用[2-3]。革兰氏阴性菌，尤其是绿脓杆菌对肉豆蔻酸异丙酯具有很强的敏感性[11]。作为传统的中草药，薄荷和樟脑都具有很好的抗炎活性、抗氧化活性及抗菌活性[6,17-18]，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌都均具有显著的抑制作用[6,9]。在饲料中添加樟脑可抑制日本鹌鹑肠道大肠杆菌的生长，并促进肠道乳酸菌的增长[10]。这些报道和本试验的结果是相一致的，体外的抑制结果表明复合物T对于大肠杆菌有很好的抑制作用，并且体积分数0.031 3%以上的复合物T对大肠杆菌的抑制率超过了质量浓度为100 mg·L-1的氨苄西林溶液。相对于对照组，复合物T 以625 mg·kg-1的添加更能促进乳鸽肠道内双歧杆菌和乳酸菌的生长。

3.3 复合物T对乳鸽生长性能的影响

有报道指出，三辛酸甘油酯可以刺激鲤鱼幼仔的生长并提高存活率[19-20]，且可以提高断奶仔猪的生长性能[5]和青年猪的饲料转化率[4]。在鸡、猪等畜禽上的应用显示，薄荷醇可以提高饲料利用率、生长性能、血液生化指标等[7-8]。Sedaghat等[10]却发现在饲料中仅添加樟脑却对日本鹌鹑的体重和饲料转化率没有显著的影响。前人的报道显示，桃金娘烯醇有很好的抗炎活性[21]，可以加速人和老鼠胃溃疡的治愈[22]；肉豆蔻酸异丙酯作为一类重要的香料和乳化剂，可直接添加在食品中以改善食品的香气与口感[23], 但将这二者作为饲料添加剂应用于畜禽中却少有报道。本试验的结果显示复合物T 以625 mg·kg-1的添加可以促进乳鸽的生长和提高饲料转化率。

3.4 复合物T对乳鸽免疫器官指数的影响

利用胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数来评价禽类的免疫状态是通常的做法[12]，免疫器官指数的提高说明饲料中的添加物能够影响家禽的免疫应答[14]。前人的研究结果表明，三辛酸甘油酯可促进断奶仔猪免疫球蛋白A(IgA)的分泌，并降低白细胞介素6(IL-6)的水平，从而提高断奶仔猪的免疫功能[5]。50 mg·kg-1的桃金娘烯醇可抑制哮喘模型大鼠的免疫因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及丙二醛 (MDA)，增加干扰素 γ(INF-γ)、白细胞介素10(IL-10)及超氧化物歧化酶(SOD)[24]。薄荷醇也可以调节白细胞介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)[25]，并可改善公鸡的免疫性能[26]。在饲料添加樟脑可增强日本鹌鹑对绵阳红细胞、禽流感病毒和新城疫病毒的体液免疫反应[10]。肉豆蔻酸异丙酯常作为促渗剂和佐剂应用于医药当中[27]，但关于其对机体免疫的影响的研究却鲜有报道。在本试验中，复合物T 以625 mg·kg-1的添加可以显著提高乳鸽的法氏囊指数，表明复合物T能影响乳鸽的免疫器官功能，但其对免疫功能的具体影响还需要后续的研究来进一步明确。

3.5 复合物T对乳鸽屠宰性能和肉品质的影响

屠宰性能是肉禽重要的生产指标，可以直接衡量养殖情况的经济效益。本试验的结果表明在基础饲粮中添加复合物T可以提高乳鸽的屠宰性能，以添加625 mg·kg-1的效果最好，尤其是胸肌率，得到显著提高。

随着消费需求从数量到质量的提升，肉品质也成为畜禽养殖中越来越重要的经济指标。pH、剪切力和失水率是评价肉品质的重要指标。pH值直接反映着肉的酸味，剪切力衡量肉的嫩度。失水率也叫持水性，衡量肉在外界环境的作用下保持其原有水分的能力[14]。本试验结果显示，对于这3个指标，各组之间的没有显著差异，说明在饲料中添加复合物T并不会影响乳鸽的肉品质。

3.6 复合物T对乳鸽血清生化指标的影响

一般药物进入血液后，其代谢主要是经过肝脏来完成，而肾脏是药物排泄的主要途径[28-29]。谷草转氨酶是评价肝功能的重要指标之一，其活性的增加提示着肝脏细胞损害的增多[28]。本试验的结果显示，空白试验组和两个试验组之间的谷草转氨酶都没有显著的差异，说明在饲料中添加313 mg·kg-1和625 mg·kg-1的复合物T不会影响乳鸽的肝功能。临床上对血清肌酐、尿素氮和尿酸的检测是了解肾功能的主要方法[28-29]。本试验对这三个指标的检测显示，各组之间也都没有显著的差异，说明在饲料中添加 313 mg·kg-1和 625 mg·kg-1的复合物T 无肾功能损害，无细胞毒性。