拟可可毛球二孢菌等7种草珊瑚内生真菌发酵产物的抑菌活性研究

蒙思妤，邓业成，廖金梅，韦坚芬，邓志勇，骆海玉

（珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006）

0 引言

【研究意义】草珊瑚[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]是传统的中草药，隶属于金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物[1]，因其成熟果实与红色珊瑚相似而得此名，又名肿节风和九节茶[2]。草珊瑚具有重要的药用价值，全株可入药，味苦、辛，性平，可用于治疗创伤性骨折、喉痛、关节肿胀和脓肿等症状[3]，同时还具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。我国民间还出现了许多具有显著效果的含草珊瑚处方，其中苗医利用草珊瑚治疗创伤性骨折的处方已经被列入国家非物质文化遗传保护名录[4]。草珊瑚植株具有较强的抗菌活性，探寻对植物和动物致病菌抑制效果显著的拮抗菌株，研发高效无害的广谱杀菌剂，对控制植物病害的危害具有重要意义。【前人研究进展】经现代化学分析技术研究，草珊瑚提取物主要含有萜类、黄酮类、香豆素、酚酸类、挥发油等成分[5-7]。在有关草珊瑚化学成分的研究中，多认为其黄酮类成分的含量与植株的质量是成正比的，即黄酮类成分含量越高，其价值就越高[8]，而在《中国药典》中则以香豆素中的异嗪皮啶含量为评判标准[9]。在抗菌活性方面，邵佳[10]发现草珊瑚总黄酮对大肠杆菌的抑制率为47.03%。郭蒙蒙[11]使用草珊瑚提取物对耐药幽门螺杆菌菌株开展了抑菌研究，于体外试验中发现其对耐药幽门螺旋杆菌有明显的抑制效果，MIC 介于 11.9～47.5 μg·mL-1，与阿莫西林等常见抗生素联合抗菌表现出协同作用，其作用机制可能与破坏幽门螺杆菌的外膜屏障功能有关。郁建生等[12]在治疗禽类细菌感染性疾病时发现，草珊瑚口服液和注射液对禽霍乱等动物病害具有良好的治疗效果。此外，宋利沙等[13]在测定草珊瑚内生真菌（橡胶生拟茎点霉菌和新壳梭孢菌）的抑菌活性时，发现其对三七灰霉病菌等7种病原真菌具有较强的抑制作用，抑菌率均达80%以上。【本研究切入点】植物内生真菌不仅能为寄主植物提供营养，为寄主植物提高抗生物和非生物逆境能力，还能与寄主植物协同进化产生具有不同生物活性的次生代谢物[14-15]。同时，植物内生真菌的发酵培养相比较于植物的生长繁殖具有不受自然环境的限制、生长成本低、可控性强以及产量高等优点，具有较强的应用潜力。近几年对于草珊瑚的研究大多集中在其化学成分、临床应用和药理研究等方向，相对其内生真菌的生物活性方面的研究报道较少。【拟解决的关键问题】拟从草珊瑚内生真菌中分离筛选出具有抗菌活性的菌种，旨在从活性菌株中进一步分离得到具有高效抑菌活性的单体化合物，有效推动草珊瑚资源的利用与发展，进一步为防治植物病害生物领域奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试内生真菌 拟可可毛球二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae），由本实验室分离。

1.1.2 供试植物病原真菌 供试植物病原真菌如表1所示。

1.1.3 供试病原细菌 供试病原细菌如表2所示。

1.2 试验方法

1.2.1 7株草珊瑚内生真菌发酵产物抗真菌活性 首先对各菌株进行活化，接着将孔径0.4 cm的菌饼接入PDB培养基中（1菌饼/100 mLPDB），置于恒温箱中（27 ℃ ) 静置培养45 d，得到发酵种子液。后使用张泽等[16]的方法，得到乙酸乙酯萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏和萃余层浸膏。再将所得滤渣使用甲醇浸泡72 h，m（滤渣）∶V（甲醇）＝1∶3，提取3次，使用超声波清洗仪提取30 min，重复抽滤3次去渣留液，浓缩蒸干滤液，即得到菌丝体甲醇萃取浸膏。

参考Deng等[17]的菌丝生长速率法，将罗汉果根腐病菌和甘蔗凤梨病菌作为指示菌株，对7株草珊瑚内生菌株进行筛选。在超净工作台中将活性菌株各个萃取层的浸膏用丙酮溶解，并稀释成质量浓度为20 mg·mL-1的药液，待用。溶解PDA培养基呈液状，待其降至50～60℃，将1 mL药液与9 mL培养基混合，摇晃均匀，配置成含药2 mg·mL-1的带药平板。将直径为0.4 cm的菌饼菌丝面朝下接种于带药平板上（3个菌饼/1个培养基），使3个菌饼在平板中心并呈一个边长为3 cm的等边三角形排列。将指示菌株接于PDA平板中点作为对照组。于（27±1）℃恒温培养箱中培养72 h，运用十字交叉法测量菌株菌落的长短直径（计量单位统一为cm），根据下列公式计算抑菌率。

式中，D0为对照组菌落直径，D1为处理组菌落直径。

1.2.2 7株草珊瑚内生真菌发酵产物抗细菌活性测定参考陆春雷等[18]、潘立卫等[19]的最低抑制浓度法并稍加修改测定7株内生真菌萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、菌丝体甲醇萃取物）对3种病原细菌的抗菌活性。将供试细菌置于牛肉膏蛋白胨液体培养基摇床发酵12 h，后用无菌水稀释10倍，待用。样品用V（丙酮）∶V（水）＝1∶1配成一系列浓度梯度。取8支试管，分别编号1-8号。1-6号试管：由高到低依次加入上述浓度梯度的0.1 mL样品药液、0.1 mL病原细菌稀释液和0.8 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基；7号试管：加等量稀释菌液和培养基，不加药液，作为阳性对照；8号试管：加入 0.1 mLV（丙酮）∶V（水）＝1∶1和等量培养基作为阴性对照。于37 ℃ 恒温培养箱中培养24 h，若试管澄清透明，摇匀后仍然澄清，认为该试管无菌生长，若试管呈现浑浊状态，表明该试管有菌生长。以无菌生长的最低浓度为MIC[20]。

1.2.3 内生真菌 J-10 发酵培养 活化 J-10 后，其发酵产物处理同 1.2.1。

1.2.4 内生真菌 J-10对 7 种植物病原真菌毒力 采用菌丝生长速率法，测定内生菌株J-10的 3 种萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌丝体甲醇萃取物）对 7 种供试植物病原真菌的抑菌活性。方法同 1.2.1，配置一定浓度梯度带药培养基。通过SPSS19.0 软件统计抑制率，再按照武怀恒等[21]的方法计算得到毒力回归方程。

1.2.5 内生真菌 J-10对11种致病细菌的最低抑制浓度 采用最低抑制浓度法，测定内生菌株J-10的 3种萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌丝体甲醇萃取物）对 11种供试致病细菌的抑菌活性，试验方法同1.2.2。

1.2.6 活性菌株的鉴定 选取抑菌效果最为显著的内生真菌J-10，观察其菌落形态，验证其生物学特征并结合光学显微镜进行形态学鉴定。再委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行ITS测序分析,将所获序列构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 7株草珊瑚内生真菌发酵产物抗真菌活性

以罗汉果根腐病菌和甘蔗凤梨病菌为指示菌株，采用菌丝生长速率法测定了7株草珊瑚内生真菌发酵产物的抑菌活性。图1为7株内生真菌菌落形态图，图2为7株内生真菌发酵产物对两种指示菌株的菌斑图（抑菌率＞50%）。7种内生真菌发酵产物对罗汉果根腐病菌和甘蔗凤梨病菌的抑制结果（表3）显示，J-10甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对两种指示菌株的抑制效果最强，抑制率介于84.84%～88.51%；G-5甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌率达86.23%和92.75%，其正丁醇萃取物对罗汉果根腐病的抑制率为73.53%；J-12乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌的抑制率为73.9%，但是其余萃取层对两种指示菌的抑制效果不佳甚至无活性。

表3 7种内生真菌发酵产物对罗汉果根腐病菌和甘蔗凤梨病菌的抑制效果Table 3 Antimicrobial activity of fermentation products of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani

图1 7种草珊瑚内生真菌菌落形态Fig.1 Colony morphologies of 7 endophytic fungi

图2 7株内生真菌发酵产物对罗汉果根腐病菌和甘蔗凤梨病菌抑制活性菌斑图（抑菌率＞50 %）Fig.2 Antimicrobial activity of secondary metabolites of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani (bacteriostatic rate＞50%)

2.2 7株草珊瑚内生真菌发酵产物抗细菌活性

以溶壁微球菌（G+）、普通变形杆菌（G-）和罗汉果青枯菌（G-）作为指示菌株，采用最低抑制浓度法测定J-9、J-10、J-12、J-20、G-4、G-5、Y-8等7株内生真菌发酵产物的抗细菌活性，结果见表4。菌株J-10的甲醇提取物和乙酸乙酯提取物对3种指示菌株均有较强的抑制活性，其MIC值均＜0.6 mg·mL-1。7种活性菌株发酵产物的甲醇和乙酸乙酯提取物对3种活性菌株的抑制活性相当，都具有一定抑制活性；除菌株J-9和J-10外，其余菌株的正丁醇提取物对3种指示菌株的抑制活性较低甚至无活性。

表4 7种内生真菌发酵产物对3种致病细菌的抑制作用Table 4 Antimicrobial activities of 7 endophytic fungi fermentation products against 3 pathogens

综合7株草珊瑚内生真菌发酵产物对2种植物病原真菌和3种致病细菌的试验结果，选择J-10菌株进一步测定其抑菌活性，以期筛选出具有广谱抑菌性且抑菌效果显著的菌株。

2.3 内生真菌J-10发酵产物对植物病原真菌的毒力

为进一步评价菌株J-10发酵产物的抑菌活性，采用生长速率法测定了J-10发酵产物的2种不同溶剂萃取物对7种常见植物致病真菌的毒力，结果如表5、图3所示。结果显示，J-10的乙酸乙酯萃取物对7种供试植物致病真菌的毒力最为显著，EC50介于0.199 5～1.172 2 mg·mL-1，其中，对玉米大斑病菌的毒力最强，对罗汉果根腐病菌的毒力最弱。J-10菌丝体甲醇提取物对7种致病真菌的EC50介于0.125 5～9.468 7 mg·mL-1，其中，对茶轮斑病菌的毒力最强，对罗汉果根腐病的毒力最弱。

图3 J-10发酵产物不同溶剂萃取层对7种植物病原真菌的抑制活性（菌斑图）Fig.3 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens (plaque diagram)

表5 J-10发酵产物不同溶剂层对7种植物病原菌的抑制活性Table 5 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens

2.4 内生真菌J-10发酵产物对11种致病细菌的最低抑制浓度

采用最低抑制浓度法测定内生真菌J-10的乙酸乙酯、正丁醇和菌丝体甲醇萃取物对11种常见致病细菌的 MIC 值。结果（表6）显示内生真菌J-10正丁醇和菌丝体甲醇萃取物对11种供试细菌的MIC介于0.125 0～5.000 0 mg·mL-1，其中，对普通变形杆菌和大肠杆菌的抑菌效果最好。其乙酸乙酯萃取物对11种供试细菌的MIC介于0.125 0～2.500 0 mg·mL-1，其中对普通变形杆菌、大肠杆菌、罗汉果青枯菌和溶壁微球菌的抑菌效果最好，均＞5.000 0 mg·mL-1，其中对蜡样芽胞杆菌的抑菌效果最好。此外，3种不同溶剂提取物对革兰氏阴性菌的抑制效果优于革兰氏阳性菌。

表6 J-10发酵产物不同溶剂层对11种致病细菌的抑制活性Table 6 Antimicrobial effects of J-10 extracts against 11 pathogens

2.5 活性内生真菌的鉴定

将菌株J-10送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，基于测序结果构建系统发育树（图4），结合菌落形态学分析，最终确定J-10为拟可可毛球二孢菌。

图4 菌株J-10的18srDNA序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 18S rDNA of J-10

2.6 内生真菌J-10菌落特征

图5为拟可可毛色二孢菌菌落形态，其菌落在PDA平板培养基上最初呈白色圆形，菌丝蓬松，生长速度快。在27 ℃的自然光条件下，24 h后测量菌落直径为49 mm，38 h后可长满培养基（d=90 mm）。大约5 d后表面颜色变为浅灰白色，培养基背面颜色变为浅灰色至灰色，圆心有一圈灰褐色菌丝，20 d后整个培养基呈现灰褐色绒状，培养基背面为黑褐色，后正背面均变为炭黑色。

图5 拟可可毛球二孢菌菌落生长形态Fig.5 Cultured L.pseudotheobromae colonies

3 讨论

本研究探讨了7种草珊瑚内生真菌的抑菌活性，发现G-5乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌的抑制活性最强，但是拟可可毛球二孢菌发酵产物甲醇和乙酸乙酯萃取物对菌株的抑制作用更为广泛，且抑制效果显著 。草珊瑚内生真菌拟可可毛球二孢菌对辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、玉米大斑病菌、贡柑链格孢菌和罗汉果根腐病菌等7种植物病原真菌具有较强的抑制作用；对普通变形杆菌、伤寒沙门氏菌、罗汉果青枯菌、大肠杆菌、溶壁微球菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌等11种致病细菌具有一定的抗菌活性。目前，草珊瑚及其亚种海南草珊瑚在我国分布较广泛，童悦[22]对二者粗提物对芒果胶孢炭疽菌抑菌效果进行比较，结果表明后者对芒果胶孢炭疽菌的活性远高于前者，前者EC50为15.85 mg·mL-1，后者EC50为1.46 mg·mL-1。张焱珍等[23]测定了77种植物提取物对12种较为常见的植物病原真菌的抑制活性，其中，海南草珊瑚0.2 mg·mL-1粗提物对玉米大斑病菌无抑菌活性。本研究在草珊瑚中分离得到拟可可毛球二孢菌，而其发酵产物乙酸乙酯层萃取物表现出较强的抗菌活性，其中，对玉米大斑病菌的EC50为0.199 5 mg·mL-1。另外，其不同溶剂萃取层对11种致病细菌MIC值介于0.125～5.000 mg·mL-1，与前人[24-27]的研究相比，拟可可毛球二孢菌的抑菌效果相对较强。此外，该菌甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对玉米大斑病菌、茶轮斑病菌和贡柑链格孢菌的抑菌活性以及该菌乙酸乙酯萃取物对辣椒炭疽病菌的抑菌活性均低于多菌灵[28]（98%原液，MIC分别为 8.765 9、7.226 9、1.422 4、1.372 9 mg·mL-1）。目前关于草珊瑚的研究仍然集中在探索其提取物的活性上，该植株的药理作用与化学成分之间的相关性尚未明确，值得进一步展开研究。

拟可可毛色二孢菌是一种生长繁殖快速、生物量较大的一种真菌，不仅能抑制上述供试致病菌的生长，同时也是一种在农业生产上危害极其严重的病原菌，广泛寄生在热带、亚热带地区一些果树和楠木[29]上，危害植物的枝干和果实，引起溃疡病[30]等病症，可致使果树枝叶及其果实腐烂。拟可可毛色二孢菌虽是一种植物致病菌，但本研究发现其次生代谢物中可能含有与抑菌有关的物质，大部分在乙酸乙酯萃取层，为寻找活性成分缩小了一定范围，为生物源抗菌剂的开发应用提供了理论依据。