水稻细条病的发生发展及抗病基因研究进展

刘 维，刘芳丹，陆展华，卢东柏，王石光，王晓飞，薛 皦，何秀英,

（1广东省农业科学院水稻研究所/广东省水稻育种新技术重点实验室，广州 510640；2华南农业大学农学院，广州 510642）

0 引言

水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak)简称细条病或BLS，是由稻黄单胞菌水稻致病变种（Xɑnthomonɑs oryzɑepv.oryzicolɑ，缩写Xoc）引起的，分布于亚热带地区的检验检疫性细菌病害，具有流行性、毁灭性和爆发性等发生特点。此病最早于1918年在菲律宾地区被发现[1]，随后广泛传播于亚洲的热带地区和亚热带地区。1955 年中国广东省首次发现该病害，一般情况下会导致水稻减产15%～25%，严重时减产40%～60%，甚至颗粒无收[2]。近几年中国超过11个省份发现有水稻细条病，主要包括华南和长江中下游稻作区，该病害严重影响水稻籽粒的灌浆充实，造成稻谷大量减产，目前已成为华南和中南稻区的主要细菌性病害[3]。科学家从病害的发生展开研究，提出加强检验检疫和合适的耕作方式是防治该病害的有效途径，化学试剂对该病害有一定的防治作用，而开展抗细条病水稻材料的鉴定与抗病基因发掘利用是控制该病害最为经济、有效的手段。

1 细菌性条斑病的危害与防治

1.1 细条病危害症状

细菌性条斑病主要危害于水稻的叶片，Xoc最初是通过气孔进入水稻的叶肉组织，随后将会侵染和危害薄壁细胞，幼龄叶片是最容易受害的。病斑最初为暗绿色的水浸状半透明小点，局限在叶脉间的薄壁细胞，随后很快在叶脉间向下扩展，最终扩展为暗绿至黄褐色的细条斑。病斑上时常会溢出大量串珠状的黄色菌脓，干燥后则呈胶状小粒依附在叶片表面上，不易脱落。危害严重时许多病斑连在一起形成大块枯死斑，随后病斑不断延伸扩展，整片叶变成红褐色、黄褐色，最后形成枯白斑。该病病状与水稻白叶枯病的病状相似，但不同的是，当用叶片对着光时可看见许多半透明的条斑。

1.2 细条病的发生情况

种子带菌是导致细条病发生的重要原因之一，同时是远距离传播该病的重要途径。在发病区，病原菌以水稻种子、稻草、稻桩及部分禾本科杂草为寄主越冬或越季，成为初侵染源，可存活超过1年[4]，在下一季水稻播种后，病原菌从秧苗鞘或叶鞘的气孔侵入并不断繁殖，完成初侵染。在插秧时通过病秧带入本田，通过流水、风雨、叶片接触等完成二次侵染。

不同水稻品种的抗病性会有所不同。一般来说常规稻抗性强于杂交稻，窄叶品种抗性强于阔叶品种，糯稻的抗性最强，其次是粳稻抗性，籼稻抗性最差[5]。抗白叶枯病的水稻品种不一定抗水稻细条病，矮杆品种抗性比高秆品种抗性强[6]。同一水稻品种最为抗病的生育时期是苗期至分蘖期，到分蘖末期时抗病力会下降，而孕穗期是最易感病的时期。

从分蘖盛期到始穗期是水稻植株抗细菌性病害能力最弱的阶段，而高温高湿的天气是致使水稻细条病发生发展的最重要的环境条件。当气温在26～30℃、相对湿度在85%以上时，容易导致此病发生[7-8]。其中引起水稻细条病大面积发生的最主要原因是台风和暴雨。

水稻细条病发生严重往往是由于田间管理不当而造成的，如迟施和偏施氮肥，漫灌串灌、低洼积水等因素。施基肥不足，追肥迟施多施、氮肥过施时很容易造成水稻植株徒长，抗病力下降，从而导致水稻植株严重发病。当植株生长旺盛时，就会导致无效分蘖数增多，植株间的空隙变小，摩擦增多，空气流通性变差，水稻抗病能力变弱，最终导致传染率增加[9-11]。

在已经感染病毒的田块作业时，如果在早晨露水未干或下雨后就进行喷药、除草等工作，病原菌很容易附着到衣服和器具上，会导致病原菌在水稻田间加速扩散，最终导致大规模水稻病害的发生。

1.3 防治措施

目前，育种家还没有培育出高抗细菌性条斑病的水稻品种，只有极少数材料具有一定的抗病性，控制水稻细菌性条斑病还主要依赖于化学药品的防治，以噻唑类化学药剂为主交替轮换使用避免病原菌产生耐药性[12]。但是在复杂的田间环境中单靠化学防治是远远不够的，需结合多种防治方法综合治理，这样才能更好地对水稻细条病的发生进行防治防控。

首先要加强植物检疫，避免从病区调种，并严格控制病种外调[13]。其次要加强疫情监控调查，在发病区域周围设立监测点，密切监测，及时掌握病情发生动态并准确采取应对措施[14]。然后是合理布局抗耐病品种，根据每个品种生育期、株高、叶片宽窄等特点，在合理的田块布置适宜的品种，避免细条病大面积爆发[15]。最后是要加强田间管理，做到合理施肥和科学控水[16]。保证基肥充足，追肥及时，增施磷肥和钾肥，避免氮肥的偏施和迟施。前期需保证浅水灌溉，薄水养蘖，配备沟渠，避免串灌和漫灌。中期以水制肥，适时晒田控氮，抑制无效分蘖。后期需改善水稻栽培环境，在收获后期要及时清除秸秆及田块中的病残体，避免稻草稻桩成为病原体的越冬场所，减少发病风险与控制成本。

2 细菌性条斑病病原菌检测

2.1 传统检测方式

2.1.1 产地检疫 在国内引种和调种前，到产地进行实地考察及全面检测，特别是在孕穗期和抽穗期，需要对繁种田块进行产地检验。这种方式十分有效，但耗时耗力，已经被当下新兴的检验检疫方式所淘汰。

2.1.2 育苗生长观测法 将种子播种在温室或田间观测幼苗的生长状况，记录其是否有在叶脉间出现暗绿色水浸状透明小点，是否最终形成暗绿色至黄褐色细条状病斑。这是一种传统而经典的检测方法，但是由于受季节与外界环境的影响，需要严格控制种植条件，同样费时费力，很难应用于大批量的检测工作中。

2.1.3 显微镜观察 在水稻细菌性病害发生的初期，还没有出现典型性症状时，由于发病部位的维管束组织和薄壁细胞上会存在大量的细菌，所以可以在低倍显微镜下进行检查，将切取的小块发病组织置于载玻片上，如果出现喷菌现象，则可判定是细菌性病害。

2.1.4 直接分离法 在固体培养基上分离并培养待测材料中的病原菌，可以有效防止其他非病原菌对检疫菌的干扰。在适当条件下培养一定时间后，可在培养基表面获得所需要的特征性菌落。

2.2 血清学检测技术

血清学技术于1918 年首次应用于植物病原菌的检测研究，随着该技术的广泛应用，目前它已成为了鉴定、检测和分类植物病原体的最有用工具之一。最常用的血清学方法有：奥氏双扩散法(ODD)、试管凝集法、免疫荧光法(IFT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、和免疫分离法等[17]。血清学检测技术对水稻细条病菌检测的应用也较为广泛。方中达等[18]通过对比白叶枯病菌、李氏禾条斑病菌和水稻细条病菌在血清学上的差异，证明了水稻细条病菌具有独特的血清学特异性。王公金等[19]和谢关林等[20]利用免疫放射检测法对水稻细菌性条斑病菌进行了快速检测，该方法制备出来的抗体虽然会与白叶枯病菌有交叉反应，但不会与其他病原菌发生交叉反应，因此可以利用此种方法对种子带菌部位和带菌率进行相应的检测。

除此之外，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫荧光法(IFT)目前也已经广泛应用于检测水稻细条病菌和水稻白叶枯病菌。由于血清学检测技术更加的灵敏快速，且具有高特异性，所以该技术也广泛应用于细菌性病原的检验检疫中。但在实际检验检疫过程中，抗血清质量通常与非同源的抗源发生交叉反应，并且有时候太过专化，因此这就制约了血清学检测技术在种子病原菌检疫中的开展和应用。

2.3 分子检测技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外核酸扩增技术，发展于20 世纪80 年代。这种以PCR 为基础的分子检测技术具有高效灵敏、稳定可靠、重复性、产率高等特点。随着近些年来生物信息学和测序技术的飞速发展和创新，目前在水稻细条病菌的检测和鉴定工作中已经有了许多不同的PCR 检测技术。其中广泛应用分子检测技术有rep-PCR(repetitive DNA-PCR)、ITS-PCR(intergenic transcribed space-PCR)、ARDRA(amplified ribosomal DNA restric-tion analysis-PCR)、和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术[21]。

Louws等[22]分析了黄单胞菌属内的不同种和致病变种，研究表明rep-PCR 指纹图谱技术可以区分出同种内的不同致病变种，如水稻细条病菌和水稻白叶枯病菌等。王春连等[23]结合传统病理学并且利用REPPCR 法和IS-PCR 法对中国长江以南的128 个水稻白叶枯病菌群体进行了遗传多样性分析，在中国的5 个鉴别品种中对128 个病原菌进行测定和病原型分群。姬广海等[24]采用Rep-PCR 技术对30 个水稻细条病菌株进行了遗传多样性分析，并且同时比较了李氏禾条斑病菌等其他10个参试菌株，实验表明了在Rep-PCR指纹图谱中，自然界中的无毒性菌株、弱菌株和毒性菌株存在很大的差异，毒性菌株的遗传分簇与其致病性具有一定的关联性。因此，此种方法可有效地检测出水稻细条病菌的遗传变异，用于菌株的鉴定和分类学研究。廖晓兰等[25]根据含铁细胞接受子基因设计了细条病菌与白叶枯病菌的特异性探针（Baiprobe 和Tiaoprobe）和通用引物PSRGF PSRGR，采用实时荧光PCR方法对1种植原体和13种细菌进行了检测，并成功建立了快速检测鉴定水稻细条病菌和水稻白叶枯病菌的实时荧光PCR 方法。研究表明目标病原菌能分别被2 个特异性探针进行特异性检测，并产生荧光信号，而其他参考菌则不能。实时荧光PCR法作为一种基因鉴定诊断方法，具有简单灵敏、稳定可靠的特点，但是由于此种方法的技术条件要求较高，仪器设备和材料费用也比较昂贵，所以在农业生产和植物检疫等方面的实际推广应用中还存在难度。

3 水稻抗细条病材料的发掘与鉴定

品种的抗病性是寄主与病原微生物协同进化的结果，抗病品种的培育和推广种植是防治植物病害最为经济环保且有效的手段。当前在试验和生产上能够利用的抗细条病材料和基因非常有限，其中抗细条病稻种资源的鉴定筛选是挖掘抗细条病新基因的基础和核心，也是当前抗细条病育种工作中首要亟待解决的问题。

夏怡厚等[26]在水稻苗期利用喷雾接种法对969份水稻品种进行抗细条病的人工接种鉴定，其中抗性品种占总数的14.55%，中抗品种占总数的55.83%，其中‘ACC8518’和‘ACC8558’是对水稻细条病具有广谱性的高抗品种，可利用其作为抗病育种的亲本。王汉荣等[27]在苗期和成株期对3343 份水稻品种进行抗细条病的人工接种鉴定。研究发现抗性品种占鉴定总数的5.77%，而中抗品种占鉴定总数的15.55%，其余品种为中感以下。岑贞陆等[28]在分蘖期利用改良针刺法对来自广西区试、国际稻圃和南宁野生稻圃的1251份稻种材料进行抗细条病的人工接种鉴定，抗性品种占0.9%，中抗品种占4.2%，其余品种为中感。肖友伦等[29]采用针刺接种法对湖南省54 个水稻主栽品种进行抗性鉴定，发现中抗以上的品种占14.81%。涂军等[30]用强致病力菌株RS105对‘镇稻88’、‘武育粳3号’等60 个水稻品种进行水稻细条病的抗性评价。研究结果表明，60个水稻品种中有8个高抗品种，占总数的13.3%；中抗品种有35个，占总数58.3%。冯爱卿等[31]利用苗期喷雾法对318 份国外稻种资源、59 个中国水稻品种以及13 个抗白叶枯病近等基因系进行了水稻细条病的抗性评价，最终筛选出了49 个抗性稻种资源。杨俊等[32]选用Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅵ型代表菌株对云南省的80个主栽和区试水稻品种进行抗性评价，筛选出9 个对3 种致病型都表现为抗性的品种，其中‘Deyou16’和‘Changgui2’表现为高抗。

4 抗细条病基因的定位与克隆

用优良抗性材料培育抗水稻细条病的品种是最为经济有效和对环境友好的防治办法，而鉴定发掘优异抗性资源和基因是抗性品种培育的关键因素[33]。曾经有不少的学者认为水稻对细条病的抗性属于数量性状抗性，而不是质量性状抗性。但随着科学技术的发展和对水稻细条病的深入研究，现在不断有新的细条病主效抗病基因或QTL被鉴定和发现，结合Khush[34]、吴为人等[35]、郑景生等[36]、何月秋等[37]、张红生等[38]、周明华等[39]、徐建龙等[40]、黄大辉等[41]、贺文爱等[42]、邹丽芳等[43]的研究结果逐步证实了不同抗源材料拥有不同的抗病遗传机制，稻种资源抗细条病的抗病遗传机制是多样性的。

因为每个QTL 的效应值较小且容易受到环境条件的影响，所以导致了细条病抗性QTL定位和克隆都比较困难，国内外关于水稻细条病的抗性QTL的克隆研究不多，且绝大多数尚处于初步定位阶段。目前共有19 个水稻细条病抗性QTLs 被检测到，分布于2、3、5、11 号等8 条染色体上，其中位于第5 号染色体短臂上的qBlsr5ɑ对抗病遗传表型变异贡献率最大。郑景生等[36]利用中抗和高抗细条病的2 个籼稻品种‘明恢86’和‘佳辐占’构建F2遗传作图群体，应用SSR 标记在水稻第2 号染色体标记RM279-RM154 之间检测到1个贡献率达13.7%的抗细条病QTL。CHEN[44]等分别利用两个群体‘Dular/Balilla’(DB)和‘Dular/IR24’(DI)，从高抗品种‘Dular’中鉴定出一个新的主效抗性QTL，命名为qBLSR-11-1，位于11 号染色体上的简单序列重复(SSR)标记RM120 和RM441 之间。Xie 等[45]将QTLqBlsr5ɑ精细定位于30 kb的范围内，并通过定量RT-PCR、测序分析和RNA 干扰技术确定LOC_Os05g01710为QTLqBlsr5ɑ的候选基因。此外，Yuan等[46]的研究结果也证实了LOC_Os05g01710不仅是细条病抗性基因，同时也是水稻白叶枯病的抗性基因xɑ5。

由主效基因控制的质量抗性性状效应大，遗传基础相对简单，一旦被鉴定，更容易在基因克隆和功能研究上取得突破。目前对水稻细条病抗性主效基因的研究仅限于遗传分析阶段，定位的报道还比较少。Triplett 等[47]利用‘传家宝’(Heirloom rice)水稻品种‘Carolina Gold Select’构建遗传群体，在4号染色体长臂1.09 Mb 的区段内检测到1 个显性主效抗性基因Xo1，该基因对亚洲细条病生理小种表现出抗病，但是对非洲细条病生理小种却表现出完全抗性。黄大辉等[48]将供体抗细条病普通野生稻‘DP3’和受体感细条病籼稻品种‘9311’通过杂交、回交和多代自交构建近等基因系。最终将普通野生稻‘DP3’的抗性基因bls1定位在RM19400 和RM510 之间21 kb 的物理范围内。施力军等[49]选择均匀分布于水稻12 条染色体上的680 对SSR 引物对抗病亲本‘DY19’和感病亲本‘9311’进行DNA多态性检测，筛选到在两亲本间具有多态性的SSR 引物261对，再利用这些多态性引物将抗细条病新基因bls2初步定位于染色体2 标记SL03与SL04 之间约4cM 的范围内。覃丽萍等[50]以高抗细条病的国际稻品种‘BJ1’与高感细条病品种‘油占8号’为亲本，构建251 个F2代单株定位分离群体，通过染色体步移法和SSR 分子标记筛选法将隐性主效抗细条病基因定位于第10 号染色体上约48.8cM处，该抗病基因与SSR标记RM258紧密连锁，是一个新的抗水稻细菌性条斑病基因位点。

5 展望

5.1 水稻细条病发病形势严峻

广西钦州市2009—2013 年水稻细条病的发生程度在1～2 级以下，2014—2018 年发生程度提升为2 级以上，其中2014 和2018 年发生程度高达3～4级，造成水稻大面积减产，严重威胁水稻安全生产[51]。安徽省六安市在2005年首次发现该病，至2008年该病危害面积发展至最大146740 hm2，重病田块水稻减产50%左右，少数田块甚至绝收。在六安市各级植保部门的共同努力下，经采取多种防治措施，近几年危害面积逐渐减少，但新的疫情点仍在增加[52]。水稻细条病在湖南省茶陵县也时常发生，1980—1988 年时病情指数为15～45，1991—2002 年时病情指数为下降为8～43，而2012—2018 年期间病情指数又上升为5.6～28，其中2017 年发生面积高达1000 hm2，2018 年发生面积为200 hm2[53]。海南省已成为是中国最重要的水稻种子生产基地，三亚、乐东、陵水等地成为水稻细条病菌发生的重灾区，病情指数和发病率都比较高，损失较为严重，然而关于海南水稻细条病菌株的研究至今未见报道，从海南运回来的稻种未经严格检验检疫，这些将严重影响海南乃至全中国水稻细条病的安全防控[54-55]。

5.2 水稻细条病的长期防控防治

强化细条病检测与防控，首先要严格按照《水稻种子产地检疫规程》，加强对水稻种植基地和流通的种子检疫监管，禁止疫情发生区种子的流通；其次要根据《水稻细菌性条斑病监测规范》要求，切实加强监督调查，密切关注发生发展动态，做到底数清、情况明，为科学防控提供有力的决策依据；第三，做好种子检测和杀菌消毒，尽量不要种带菌种子，抓住水稻易感孕穗期，周期性进行药剂防治，提高科学防控效果；第四，加强防控指导，开展防控技术培训，特别是病害发生关键时期，发放防治药物，深入田间地头，手把手指导农民科学防控，提高防治效果。

5.3 抗病品种的培育是防治病害的有效手段

中国拥有丰富的稻种资源，普通野生稻作为亚洲栽培稻的祖先，蕴含着丰富的抗病基因源，然而，在生产上还未见抗细条病品种大面积推广应用。抗病材料的鉴定是抗病基因发掘的基础，抗病基因发掘是抗病品种培育的核心。生产上能够利用的抗细条病材料和基因非常有限，一方面要细化细条病鉴定方法，加强抗病材料的筛选；另一方面，前人鉴定到的抗细条病材料，如‘ACC8518’、‘ACC8558’、‘Deyou16’和‘Changgui2’等，在没有克隆的相应抗病基因之前，也可以利用传统杂交育种和系谱选育的方法进行抗细条病品种的培育；另外，抗细条病基因的克隆和分子机理解析将为抗病品种的培育提供最佳的基因资源。