阿尔茨海默病转基因小鼠模型研究进展

孙琦月

江苏护理职业学院，江苏省淮安市 213001

阿尔茨海默氏病(AD)是最常见的神经退行性疾病，患者的表现往往是以认知功能的减退为主，导致严重痴呆。超过95%的AD病例是晚期的，最大的危险因素是高龄，其他危险因素包括APOE4等位基因突变、心血管疾病危险因素、炎症和创伤性脑损伤[1]。AD分为家族性AD和散发性AD。散发性AD 占大多数，但目前发现与散发型AD相关的基因仅载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)。家族性AD占AD发病总人数的5%左右[2]。关于AD发病的具体机制尚未有明确报道，只是提出一些假说，基于这些假说，建立多种动物模型，如慢性缺血性痴呆模型、Aβ脑内注射模型、铝元素中毒模型等，但这些模型模拟AD发病过程过于局限并不全面。转基因小鼠成为目前临床药物研究中较多使用的一种动物模型，因为其有明确的致病因素，并且行为学和病理学均有明显的可检测的缺陷[3]。关于转基因小鼠，目前可分为两个大类，一种是表达突变基因，另一种是有无效基因的基因敲除鼠。本文就转基因小鼠的理论基础、评价做进一步介绍，但对基因敲除鼠暂不介绍。

AD转基因小鼠模型基于AD病理学改变，其特征性病变是细胞外Aβ沉积形成的老年斑(Senile plaque, SP)、细胞内的Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)，晚期AD患者的大脑因大面积萎缩而细胞丢失。目前的说法认为Aβ的大量沉积是引起AD原因之一，其中淀粉样前体蛋白(APP)和早老素1、2(PS1，PS2)的突变会导致Aβ的沉积。APP蛋白是一种跨膜运输的蛋白，在神经元的细胞膜外,在APP基因中发现了第一个导致AD的基因突变。APP被α，β，γ裂解酶裂解，正常情况下生成Aβ，突变的APP基因有利于β，γ裂解酶对APP的水解加工，使Aβ生成与代谢失衡，促进Aβ的聚集[1]。早老素1、2的突变导致APP中γ-断裂的移位，产生更多的淀粉样蛋白Aβ42，脑中Aβ42/Aβ40的比例增高[4]。基于以上致病基因，以及典型的AD病理学特征，临床上制备了大量的转基因小鼠，以供AD的研究，根据小鼠体内转入的基因种类，可分为单转基因鼠和多转基因鼠。

1 单转基因鼠

临床上AD的单转基因鼠包括单转APP鼠、单转PS鼠以及Tau蛋白转基因小鼠，而APOE小鼠大多是基因敲除鼠，这里不予论述。因转入的基因带有不同的突变位点，上述单转基因鼠又分为不同的品系。

1.1 单转APP鼠 现APP基因中发现20多个突变基因，其中一些被广泛用于转基因小鼠模型的构建。其中较多使用的单转APP转基因小鼠有APPV717I转基因小鼠、Tg2576小鼠、APP23转基因小鼠等。(1)随着对AD病因的研究发现，性别是影响AD的重要因素之一，其中APPV717I转基因小鼠随年龄和性别有明显的行为差异，提示APPV717I转基因小鼠可能是研究AD性别差异的一个很好的候选小鼠。病理学方面，一些研究表明生命后期的APPV717I小鼠脑中有淀粉样斑块；行为学方面显示，相同月龄小鼠在运动能力方面无明显差异，6月龄时雄性小鼠有较明显的焦虑；记忆方面显示10月龄时出现损伤。该小鼠是研究AD性别差异的一个很好的候选[5]。(2)在APP转基因鼠中，有一部分转基因鼠过表达APP(APPswe)的瑞典双突变(K670N/M671L)，Tg2576小鼠作为其中一种较多被使用，Tg2576小鼠4～5个月时明显检测到Aβ，6个月初步表现出老年痴呆的症状，但并未观察到Aβ斑块，属AD发病早期，Aβ沉积、记忆缺损出现在10～12个月时,11～13个月时脑内Aβ1～42/43的数量升高明显，15～18个月出现突触的丢失，属于阿尔茨海默病发病末期[6-7]，Tg2576小鼠在受影响的脑区内没有表现出任何显著的神经元丢失，但最近的研究显示，15～18个月的Tg2576小鼠在电镜水平下可观察到内嗅皮质的突触密度显著降低，此外，突触密度的降低与Aβ斑块的邻近程度相关[8]。该鼠在饲养中性格较为暴躁，较难对其进行群居性研究。(3)另一个APP双突变基因鼠APP23，与Tg2576不同，它是利用较长的751种氨基酸形式的APP，表达通过小鼠THY-1.2启动子驱动，APP23 转基因小鼠 6月龄时皮质和海马区开始出现 Aβ 沉积，并随月龄增加而逐渐沉积；老年斑在8～9月龄时可检测到[9]，14～18月龄时，海马CA1区的神经细胞出现丢失，这与Tg2576不同。24月龄出现炎症反应。此模型较好地模拟了AD患者老年斑形成的病理性发展。也是唯一一个报道有神经元丢失的APP小鼠模型。

除此之外还有J20小鼠、APP22小鼠、TgCRND8小鼠模型，转入的APP基因带有两种突变，此类型转基因鼠只能模仿AD的部分病理特征，临床上不被广泛使用，且相关的报道有限。APP转基因鼠模拟了AD患者的脑内Aβ沉积和SP形成，主要用于研究APP、Aβ与AD的发病关系及临床药效学评价。但是该类小鼠模型却存在一些缺陷，如该类小鼠脑内没有发现Tau蛋白的过度磷酸化、NFTs，APP转基因小鼠在中枢神经系统中没有发现广泛的神经元死亡，这可能是因为AD患者的病变时间较漫长，而该转基因小鼠的寿命过短[10]。目前APP转基因鼠通过与其他致AD基因的转基因鼠杂交从而产生多转基因鼠，可以更全面显示出AD的病理及行为学变化。

1.2 单转PS小鼠 早老素的突变也导致FAD，迄今已鉴定出近200个突变，突变的基因有两种即PS1和PS2。突变导致了APP水解过程中γ-断裂的移位，使得Aβ42的增加，脑中Aβ42/Aβ40的比例增高。目前研究者已经建立了多种突变体PS1或PS2转基因小鼠。理想的动物模型要表现出AD典型的病理特征和行为特征。但PS转基因小鼠的大脑中没有发现斑块的产生，并且其行为学方面的改变也并未观察到。这可能是人与小鼠之间Aβ序列不同导致聚集的倾向降低的结果[4]。

在众多PS转基因小鼠中，PS1M146L小鼠是经典的PS1转基因鼠，29月龄可见较多 Aβ42，小鼠此时表现出线粒体活性的变化等，其行为学改变及病理变化未见报道。而其他品系的小鼠PSEN1(P117L)(line 13)与PSEN1-YAC(line G9)小鼠脑内发现Aβ42增高，但仍未发现Aβ沉积等病理变化以及行为学改变[8]。PS-21在子代小鼠体内可有Aβ增多，但未沉积。可进行抑制β-淀粉样蛋白产生方面的研究[11]，关于此类型的小鼠模型文献报道有限。

因此研究者们在PS1小鼠体内转入其他突变致病基因(如APP基因、Tau蛋白相关等)从而建立双转基因鼠和多转基因鼠。此时惊喜地发现此类小鼠可以模拟部分AD的病理学及行为学特征。单独表达PS1/PS2基因的小鼠虽然会出现某些病理改变，但行为损害程度较轻微[12]，且在模仿AD 的病理变化方面表现过于片面，所以多用于与其他转基因鼠杂交产生多转基因小鼠。

1.3 Tau蛋白转基因小鼠模型 有毒蛋白Tau是AD脑中的一个重要生物学特征，Tau在大脑的位置和程度与AD认知症状相关，其产生Tau蛋白的微管相关蛋白基因的突变与Tau具有相关性。Tau蛋白的变性会形成有害的神经纤维缠结，从而影响神经元的活性[13]。

JNPL3转基因小鼠的出现，证明了Tau 蛋白会对神经元造成损害，引起细胞的丢失与行为的异常。病理学方面，6月龄时即可出现神经元丢失，神经纤维缠结出现在9月龄。行为学方面在10月龄表现出运动障碍，只有不到10%的动物未出现，但是不会出现 Aβ淀粉样斑块和认知障碍[14]。JNPL3小鼠较多的被用于研究NFTs与AD发病之间的关系与机制。Tau基因有多种突变位点，其中P301L等位点的基因突变引起AD。目前已发现P301L的突变基因有30多种，其中 rTg4510 转基因小鼠的病理表现较接近AD，病理学方面，2.5个月时，在新皮层和海马CAI区开始出现NTF，4个月时，NFT数量逐渐累积，稳定表达，5.5个月时，海马CAI区的NFT出现丢失，8.5个月后NFT大量丢失。行为学方面，2.5个月时认知记忆功能出现障碍，并且随着月龄逐渐加重，但在确定转基因Tau蛋白抑制对神经元丢失和脑萎缩的影响时发现，抑制TauP301L时，神经元的丢失与脑重量减轻的现象同时得到抑制，但NFTs稳定增高。且该模型的NFTs损失数量远远超过人类AD患者，这也是该模型的局限性[14]。Tau蛋白转基因小鼠模型可以很好地将神经纤维缠结这种AD患者的病理表现模拟出来，并且出现行为学的改变，但是未发现Aβ沉积。因此，只能进行单一的Tau蛋白相关的研究[13]。

2 多转基因鼠

为了更全面的模拟AD的病理学特征，临床上在单转基因鼠的基础上，转入更多的致病基因，制备了双转基因鼠和三转基因鼠，大大弥补了单转基因小鼠在模拟AD病理变化上的不足，为临床实验与药物研究提供了更好的动物模型。

2.1 双转基因鼠 APP/PS1双转基因鼠：将APP与PS1两个易感基因整合后制备的APP/PS1双转基因鼠近年来较多的在国内外实验中使用。APP/PS1双转基因小鼠主要包括APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1L166P、APPswe/PS1M146L等[15]。相比其他双转基因鼠，APPswe/PS1dE9小鼠出现较晚，但因其出现Aβ较早，并随月龄增长而增加，在AD的防治研究中较多的被使用。有研究证明[16]，行为学方面，APPswe/PS1dE9小鼠随月龄增加而出现运动障碍，7～8个月出现学习障碍和认知功能损伤。在病理学方面，6周在大脑皮层发现Aβ沉淀，3～6个月在海马皮层和纹状体、丘脑上出现Aβ沉积，大约在4～5个月Aβ会表达在脑干上，Tau磷酸化和神经炎表现，NFTs没有观测到。APPswe/PS1dE9双转基因小鼠早期即出现Aβ的沉积，并且与月龄的增长呈现正相关，大月龄的小鼠在行为学方面与病理学方面均有明显改变，与AD患者的疾病变化相类似，因此是较理想的模型，广泛应用于AD的防治研究中[17]。

最近的一种被称为TGF 344 AD大鼠的AD动物模型，是通过向大鼠原核注射“瑞典”突变体人淀粉样前体蛋白(APPsw)和Δ外显子9突变体人早老素-1(PS1ΔE9)而发育的。较好地模拟了AD早期空间导航功能障碍的问题，这可能是临床前阿尔茨海默病的一个决定性行为标志。病理学方面显示出特征性斑块形成、内源性缠结发病机制以及神经炎症、神经血管功能障碍和细胞丢失[18]。行为学方面的表现主要体现在10～11个月时出现明显的空间导航障碍。该模型为阐明AD空间定向障碍的神经生物学机制提供了实质性的希望[19]。

5× FAD模型：即APP/PS1双转基因小鼠携带三个APP突变体及两个PS1突变体，同时表达5种FAD突变。在认知功能方面，表现出多种类型的认知功能紊乱，更加接近于临床上AD患者出现的多种认知功能下降的表现；在神经病理学方面，此类型转基因鼠的Aβ42沉积速度非常快，1月龄左右时即可观测到，2月龄时Aβ沉积已很明显，尤其是在下托和深皮质层。神经胶质过多症也在2个月左右出现，4个月左右，突触丢失及行为和记忆损害，神经元丢失发生在9月龄，位置在Aβ沉积区[10]。该模型未观察到神经纤维。此模型的优点在于对AD患者临床病理特征的模拟较好，并且可以在较短的时间里产生大量的Aβ1～42，是适合研究神经元内 Aβ42 诱导的神经元退化和斑块形成的动物模型。虽然研究5×FAD转基因动物模型较晚，但国外的一些研究团队已经将5×FAD转基因小鼠作为动物模型进行初步的药物研究[20-21]。

TAPP双转基因小鼠在行为学的发病方式及出现时间方面同JNPL3转基因小鼠相似，在病理学方面，可以同时出现Aβ沉积和NFTs，Aβ的变化与Tg2576 转基因小鼠相似，可观测到大量NFTs[13]，此种模型小鼠首次出现了AD两大病理征，但是关于该型鼠的文献并不多见。

2.2 多重转基因模型 目前国际上已经制备了APP/PS1/Tau三转基因小鼠，携带有PS1M146V基因、APPSwe基因和TauP301L基因。祝艳秋等人的研究发现，4月龄时出现记忆功能障碍、昼夜节律紊乱的变化。6月龄时海马 CA1、额叶和皮质出现Aβ沉积，H2O2产物明显增高，并出现短期记忆功能障碍及氧化应激。其中Aβ的出现与月龄有较大的相关性，12月龄其皮质、海马区Aβ 沉积明显，出现NFT，先海马后皮质。15月龄后皮质区 Aβ沉积明显Tau 蛋白高度磷酸化，首现 PHFs。在对比不同实验室中的APP/PS1/Tau三转基因小鼠发现，其脑内的病理变化存在差异性，在对比了雌性和雄性转基因鼠的病理变化可以看出，雌性小鼠的病理变化更加明显[22]。基于此可以发现，该型小鼠有较大的性别差异性，可以进行性别相关的研究，其具体的病理表现会存在不同实验室之间的差异性，因此在选择该型小鼠进行实验时，要对小鼠的月龄、性别、繁殖、品系以及居住条件等问题严格把关[23]。

三转基因鼠能模拟较为复杂的AD病理变化，但是存在许多问题，如成膜周期较长、造价昂贵、基因表达不稳定等，因此在使用该型小鼠时，要严格注意其月龄、性别、饲养方式等带来的行为学以及病理学的差异性。

3 讨论

AD的病因复杂且多样，这在一定程度上限制了对于AD治疗的研究。为了可以研究出有效的防治手段，亟须建立较为理想的动物模型。研究认为，理想的AD动物模型除了具备AD的典型病理学、行为学特征，如神经元死亡、突触丢失、记忆认知功能障碍等之外，AD患者还具有氧化应激、神经炎症、小胶质细胞激活等病理特征，转基因小鼠可以对遗传性AD进行较好的研究，但遗传性AD占比不足10%，因此不具有典型的AD代表性，并且，转基因模型只能表现AD的部分病理特征，并且受到经济、实用性等因素的限制。尽管现在的AD动物模型并不完善，随着研究的深入，终将建立理想的AD模型，加速对AD病因病机及治疗的研究进程。