2种瑶方合剂微生物限度检查方法适用性试验的研究

庞云娟， 刘康连*， 庞兰英， 谢庚霖， 龙文洲， 刘 元

(1.广西壮族自治区玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林 537000，2.广西壮族自治区玉林市中医医院，广西 玉林 537000，3.广西子持医药科技有限公司，广西 南宁 530299)

依据2020年版《中国药典》对瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂的微生物计数法进行适用性试验研究，为有抑菌作用，且不适宜采用平皿倾注法进行需氧菌总数计数的液体制剂提供适用性试验的方法参考。

1 材料

1.1 菌株 枯草芽孢杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌(实验室传代批号枯草-3-20200422、黑曲-2-20150330、金葡-2-20200401、白念-3-20200401、铜绿-2-20200401、大肠-2-20200401)，上述菌株的0代(冻干粉菌种)均购自广东环凯微生物科技有限公司，实验室复活并传代培养[1-2]。对枯草芽孢杆菌种进行显微形态确认，对黑曲霉菌种进行菌落形态确认后，对其余4个菌种进行VITEK鉴定确认，制备成甘油冻存管于超低温冰箱保存。实验之前取甘油冻存管菌种传代培养，制成新鲜肉汤菌液，黑曲霉制成孢子菌悬液。

1.2 药物 瑶方祛湿合剂(批号190923、190924、190925)和瑶方胃安合剂(批号190916、190917、190918)均由玉林市中医医院提供。

1.3 试剂 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)、麦康凯液体培养基(MacB)、麦康凯琼脂培养基(MacC)，均为购自北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠购自广东光华科技股份有限公司。

1.4 仪器 电子天平(日本岛津公司，型号EK-1200i)；霉菌培养箱(广东省医疗器械厂，型号LRH-150-M，校准温度点23.0 ℃)；生化培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司，型号SPX-150F-Ⅱ，校准温度点33.0 ℃)；生化培养箱(德国宾得公司，型号KB115，校准温度点42.0 ℃)；Ⅱ级生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司，型号BHC-1300HA2)；立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司，型号SQ810C，校准温度点121.0 ℃和115.0 ℃)；细菌鉴定及药敏测试仪(法国生物梅里埃公司，型号VITEK 2)；显微镜(德国徕卡公司，型号DM500)；微生物洁净实验室(洁净度B、C、D级)、圆周振荡器(德国IKA公司，型号S25) ；超低温冰箱(新加坡ESCO公司，型号VVS-439B-1)；普通冰箱(美的集团股份有限公司，型号BCD-229UTM)；微生物检验仪(浙江泰林生物技术股份有限公司，型号HTY-310)；电动助吸器(德国Eppendorf公司，型号Easypet 3)。

2 方法

2.1 菌悬液的制备 根据2020年版《中国药典》四部通则1105[1]中关于试验菌液的制备和使用要求，并参考文献[3-6]制备方法进行接种培养，取肉汤菌液或孢子菌液0.1 mL加至9.9 mL生理盐水中，作为1×10-1级别，混合均匀后从1×10-1级别中取1 mL加至9 mL生理盐水中，作为1×10-2级别，再依次制备成1×10-3～1×10-6级别的菌悬液，依次吸取1 mL注皿培养进行菌液计数。取菌数不大于10 000 cfu级别的菌悬液作为平皿倾注法试验的使用菌悬液，备用；取菌数不大于100 cfu级别的菌悬液作为薄膜过滤贴膜法试验和控制菌检查试验的使用菌液，备用。

2.2 供试液的制备 用稀释液(灭菌的pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液)将样品原液依次制成1∶2、1∶5、1∶10、1∶20的供试液。

2.3 预试验

2.3.1 初步平皿倾注法预试验 于10 mL瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂(原液及1∶2、1∶5、1∶10供试液)以及稀释液中，分别加入0.1 mL “2.1” 项下不大于10 000 cfu的金黄色葡萄球菌悬液[3-21]，充分摇匀；再取10 mL瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂(原液、1∶2供试液)以及稀释液，分别加入0.1 mL “2.1” 项下不大于10 000 cfu的白色念珠菌悬液，充分摇匀[6]。上述含药菌液分别倾注于平皿中，每皿1 mL，其中白色念珠菌平皿倾注SDA，金黄色葡萄球菌平皿倾注TSA，琼脂凝固后，将SDA平皿放到霉菌培养箱23 ℃培养不超过5 d，将TSA平皿放生化培养箱33 ℃培养不超过3 d。若预试验回收比值达不到0.5，则继续进行薄膜过滤法预试验。

2.3.2 薄膜过滤法预试验 冲洗液为灭菌0.9%氯化钠溶液，冲洗量从100 mL开始，瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂(1∶10供试液)10 mL过膜[6-9]。若样品溶液产生堵膜的，则需要采取原液稀释(1∶20，1 mL/皿)、原液稀释结合培养基稀释(1∶10、1∶20，0.5 mL/皿)的平皿倾注法，及1∶10供试液1 mL/膜的薄膜过滤法进行进一步的预试验[10]。

2.4 微生物计数方法适用性验证试验

2.4.1 霉菌和酵母菌总数的计数方法验证(平皿倾注法) 于10 mL瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂(原液，各3个批号)以及稀释液中，分别加入0.1 mL “2.1” 项下不大于10 000 cfu的黑曲霉、白色念珠菌悬液，充分摇匀，按照“2.3.1”项下方法进行注皿，倾注SDA，黑曲霉试验组SDA平皿培养不超过3 d[14-17]。

2.4.2 需氧菌总数的计数方法验证(薄膜过滤贴膜法) 将灭菌薄膜过滤杯套紧泵头，滤杯先加入约20 mL稀释液润湿滤膜(此时不抽滤)，再分别加入供试液(瑶方祛湿合剂1∶10供试液10 mL，瑶方胃安合剂1∶10供试液1 mL，试验组)、稀释液(菌液组)、供试液(供试品对照组)，然后分别取“2.1” 项下不大于100 cfu的菌液1 mL，并缓慢地把菌液分散打进薄膜过滤杯中与试验组溶液或者菌液组溶液相混，抽滤，分别按100 mL/膜的冲洗量冲洗，滤干后取膜贴种于提前备好的TSA平板(7 cm)[18-21]，于生化培养箱33 ℃培养，其中枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的贴膜试验组平皿培养不超过1 d，金黄色葡萄球菌、黑曲霉试验组培养不超过3 d，白色念珠菌试验组平皿培养不超过5 d。

回收比值=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数。回收比值应在0.5～2范围内，若任比值低于0.5，应重点分析样品是否存在批次差异；若任比值大于2，应重点分析实验操作以及菌液的稳定性，并重新进行适用性试验研究[22]。

2.5 控制菌-大肠埃希菌检查方法适用性试验(增菌液常规法) 分别取瑶方祛湿合剂3批和瑶方胃安合剂3批1 mL原液(或1∶10，10 mL)，接种于100 mL TSB，分为试验组、阴性菌对照组。试验组加入不大于100 cfu的大肠埃希菌，阴性菌对照组加入不大于100 cfu的金黄色葡萄球菌，放置于生化培养箱33 ℃培养24 h，取1 mL各组培养物接种于100 mL MacB，放置于生化培养箱42 ℃培养24 h，取MacB培养物划线接种于MacC琼脂平板，放置于生化培养箱33 ℃培养24 h，观察其菌落形态[23-26]。

3 结果

3.1 需氧菌总数计数方法预试验 如表1～2所示，瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂都有抑制金黄色葡萄球菌的作用，采用原液稀释10倍以内(含)的平皿倾注法均不能消除其抑菌作用。瑶方祛湿合剂采用原液薄膜过滤贴膜法(1∶10，10 mL，冲洗100 mL/膜)回收比值为0.83。瑶方胃安合剂1∶10供试液10 mL薄膜过滤会发生堵膜，1∶20 (1 mL/皿)、1∶10 (0.5 mL/皿)、1∶20 (0.5 mL/皿)也不能消除其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，而减少薄膜过滤的样品量可以解决薄膜过滤堵膜的问题，采用原液稀释10倍薄膜过滤贴膜法(1∶10，1 mL，冲洗100 mL/膜)回收比值为0.65。

表1 初步平皿倾注法预试验——金黄色葡萄球菌回收比值(cfu/皿，n=2)

3.2 霉菌和酵母菌总数计数方法预试验 如表3所示，瑶方祛湿合剂和瑶方胃安合剂都没有抑制白色念珠菌的作用，采用原液平皿倾注法(原液1 mL/皿)即可满足回收比值的要求。

3.3 微生物计数方法适用性试验验证 如表4所示，采用原液薄膜过滤贴膜法(1∶10，10 mL，冲洗100 mL/膜)、原液稀释10倍薄膜过滤贴膜法(1∶10，1 mL，冲洗100 mL/膜)分别对瑶方祛湿合剂、瑶方胃安合剂进行需氧菌总数计数试验，TSA平皿上5种试验菌的回收比值均符合要求；采用原液平皿倾注法(原液1 mL/皿)对瑶方祛湿合剂、瑶方胃安合剂进行霉菌和酵母菌总数计数进行适用性试验，SDA平皿上2种试验菌的回收比值均符合要求，符合《中国药典》2020年版四部1105的规定。

表2 薄膜过滤法预试验和进一步的预试验——金黄色葡萄球菌回收比值(cfu/皿，n=2)

表3 平皿倾注法预试验——白色念珠菌回收比值(cfu/皿，n=2)

表4 2种合剂微生物计数方法验证试验的回收比值

3.4 控制菌-大肠埃希菌检查方法适用性试验 如表5所示，采用增菌液常规法对瑶方祛湿合剂、瑶方胃安合剂的控制菌-大肠埃希菌进行适用性试验，符合《中国药典》2020年版四部1106的规定。

表5 2种合剂大肠埃希菌的适用性试验

4 讨论

瑶方祛湿合剂、瑶方胃安合剂表现出对金黄色葡萄球菌较强的抑制作用，而对白色念珠菌、大肠埃希菌几乎没有抑菌作用，所以本研究重点在于需氧菌总数计数方法的适用性试验。合剂的需氧菌总数不得过1×102cfu/mL，验证方案一般先按照原液1 mL/皿、原液稀释2倍1 mL/皿、原液稀释5倍1 mL/皿、原液稀释10倍1 mL/皿的顺序进行，当原液没有抑菌作用时选原液1 mL/皿的方法；当原液1 mL/皿的加菌回收比值达不到0.5的时候，要对原液稀释平皿法、薄膜过滤法、以及实验室自身的资源进行综合考量。实验室具备较好的薄膜过滤资源，且容易过滤的样品采用薄膜过滤法1∶10供试液10 mL(即原液1 mL)/膜的方法更优；实验室缺乏薄膜过滤相应资源的，也可考虑原液稀释平皿法。当原液稀释10倍1 mL/皿的加菌回收比值仍达不到0.5的要求，而且1∶10供试液10 mL(即原液1 mL)过滤产生堵膜的情况，应考虑1∶10供试液1 mL薄膜过滤的情况，能够过滤的话，还是优先选择1∶10供试液1 mL薄膜过滤的方法。