毛兰素通过调控lncRNA LINC01354/miR-515-5p对前列腺癌细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的影响

董建设， 赵俊峰， 张林超， 陈瑞廷， 于小明

(河南省中医院泌尿外科，河南 郑州 450000)

前列腺癌是生殖系统和泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，也是老年男性的主要健康问题[1-2]。由于早期筛查和癌症治疗方案的重要进展，过去40年间前列腺癌患者的总生存率和5年生存率有所提高[3]。但是，一旦疾病发展为去势抵抗性前列腺癌，预后将急剧恶化[4-5]。因此，进一步阐明前列腺癌进展的分子机制对于寻找有效的治疗方法具有重要意义。毛兰素是从石斛中提取的联苄类化合物，研究表明，毛兰素可抑制肺癌A549细胞活力，诱导细胞凋亡[6]；还可有效抑制葡萄膜黑色素瘤细胞C918、MUM-2B的增殖，阻滞细胞周期，促进葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡[7]；能够抑制膀胱癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期[8]。根据报道，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)LINC01354在甲状腺癌中异常表达[9]，可作为肺腺癌特异性诊断和预后的独立生物标志物[10]。LINC01354在非小细胞肺癌组织和细胞中高表达，敲低其表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭[11]。资料显示，miR-515-5p在前列腺癌组织和细胞中低表达，抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。但毛兰素和LINC01354对前列腺癌细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的影响，以及LINC01354与miR-515-5p的靶向关系，且毛兰素是否通过调控lncRNALINC01354/miR-515-5p影响前列腺癌细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭目前还尚未可知。因此，本研究以前列腺癌细胞DU145为对象，评价毛兰素在细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解中的功能，旨在阐明其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 人前列腺癌细胞株DU145购自中国科学院细胞研究所。

1.2 试剂与药物 毛兰素(纯度≥99.7%，批号111874-201603)购自中国食品药品检定研究院。DMEM培养基购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、RIPA缓冲液购自美国Sigma-Aldrich公司；LINC01354过表达/小干扰RNA(pcDNA-LINC01354/si-LINC01354)、各自阴性对照(pcDNA/si-NC)、miR-515-5p模拟物、模拟物阴性对照miR-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；葡萄糖测定试剂盒购自美国BioVision公司；乳酸测定试剂盒、双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室(8 μm孔径)、基质胶购自美国BD Biosciences公司；增强的化学发光液购自美国EMD Millipore公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR、SYBR Green Master Mix购自日本TaKaRa公司；荧光素酶载体、荧光素酶报告基因测定系统购自美国Promega公司；细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases，MMP)-2、MMP-9、GAPDH一抗和辣根过氧化物酶结合的IgG二抗均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3 细胞培养与分组 DU145细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2潮湿培养箱中培养。毛兰素使用二甲基亚砜(DMSO，终浓度0.1%)助溶，并用DMEM培养基稀释至相应剂量[6]。细胞分为对照组(0.1% DMSO)，毛兰素低、中、高剂量组(20、40、80 nmol/L毛兰素)，pcDNA组(转染pcDNA)，pcDNA-LINC01354组(转染pcDNA-LINC01354)，si-NC组(转染si-NC)，si-LINC01354组(转染si-LINC01354)，毛兰素+pcDNA组(转染pcDNA并给予80 nmol/L毛兰素)，毛兰素+pcDNA-LINC01354组(转染pcDNA-LINC01354并给予80 nmol/L毛兰素)，毛兰素作用时间均为48 h。将DU145细胞以每孔2×105个的密度接种至6孔板，根据说明书操作步骤，通过Lipofectamine 2000与转染复合物一起孵育24 h，进行转染，再通过RT-qPCR检测转染效率，用于后续实验。

1.4 葡萄糖消耗和乳酸水平检测 DU145细胞在无葡萄糖的DMEM培养基中培养16 h，然后在常氧条件下与高葡萄糖DMEM培养基再孵育24 h，去除培养基，使用基于荧光的葡萄糖测定试剂盒检测DU145细胞内葡萄糖水平，使用基于乳酸氧化酶的比色测定法在540 nm波长处读取吸光度，并计算乳酸水平[13]。

1.5 MTT法检测细胞增殖 DU145细胞以每孔5×103个的密度接种至96孔板，按“1.3”项下分组并孵育48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续孵育3～4 h，去除上清液，加入200 μL DMSO振荡20 min，使用Epoch微孔板分光光度计在490 nm波长处检测光密度(OD)值，并计算细胞增殖抑制率。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 将无血清DMEM培养基稀释的DU145细胞以每孔4×104个的密度接种至Transwell小室上室，并将含10%胎牛血清的DMEM培养基加入到下室，培养24 h，用棉签除去膜上侧的细胞，膜下侧的细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min，并在室温下用0.1%结晶紫染色30 min，侵袭实验则需在Transwell小室的上室包被基质胶。使用光学显微镜获取图像，计数迁移、侵袭细胞数。

1.7 Western blot法检测细胞中cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集各组细胞，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，置于冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，使用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒检测蛋白浓度并定量。将蛋白与上样缓冲液混合煮沸10 min进行变性，取40 μg蛋白样品通过10% SDS-PAGE胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，室温下封闭2 h，加入一抗cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜，加入辣根过氧化物酶结合的IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，采用增强的化学发光液曝光显影，以GAPDH为内参，分析cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达。

1.8 RT-qPCR法检测细胞LINC01354和miR-515-5pmRNA表达 收集各组细胞，使用TRIzol试剂从细胞中分离总RNA，逆转录为cDNA并定量2 μg。LINC01354正向引物序列5′-GCAATGGTTTGGGCAACTGTAT-3′，反向引物序列5′-GAAAAAGCAAGCTGCCATGAGA-3′；miR-515-5p正向引物序列5′-CGGGTTCTCCAAAAGAAAGCA-3′，反向引物序列5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；GAPDH正向引物序列5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物序列5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。使用GAPDH和U6对lncRNA和miRNA的表达进行标准化，以2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达。

1.9 荧光素酶报告基因检测 应用在线软件LncBase Predicted v.2鉴定出miR-515-5p作为LINC01354的潜在靶标。将含有miR-515-5p假定结合位点的LINC01354野生型3’非编码区(3’UTR)及其突变体扩增并克隆到psiCHECK-2荧光素酶启动子载体中，产生WT-LINC01354或MUT-LINC01354质粒。然后使用Lipofectamine 2000试剂将WT-LINC01354或MUT-LINC01354与miR-515-5p模拟物或miR-NC共转染DU145细胞，48 h后收集细胞，并根据说明书使用荧光素酶报告基因测定系统评估荧光素酶活性。

2 结果

2.1 毛兰素对DU145细胞糖酵解的影响 如表1所示，与对照组比较，毛兰素各剂量组细胞葡萄糖消耗和乳酸水平均减少(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

表1 毛兰素对DU145细胞糖酵解的影响

2.2 毛兰素对DU145细胞增殖的影响 如图1、表2所示，与对照组比较，毛兰素各剂量组细胞增殖抑制率和p21蛋白表达升高(P<0.05)，cyclin D1蛋白表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

图1 细胞增殖相关蛋白表达

表2 毛兰素对DU145细胞增殖的影响

2.3 毛兰素对DU145细胞迁移和侵袭的影响 如图2、表3所示，与对照组比较，毛兰素各剂量组迁移和侵袭细胞数减少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

注：A为迁移和侵袭相关蛋白表达，B为DU145细胞迁移和侵袭实验(×200)。

表3 毛兰素对DU145细胞迁移和侵袭的影响

2.4 毛兰素对DU145细胞LINC01354、miR-515-5pmRNA表达的影响 如表4所示，与对照组比较，毛兰素各剂量组细胞内LINC01354表达降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表达升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性(P<0.05)。

表4 毛兰素对DU145细胞中LINC01354、miR-515-5p mRNA表达的影响

2.5LINC01354靶向调控miR-515-5p表达 如图3、表5所示，LINC01354与miR-515-5p含有互补的核苷酸序列。与miR-NC组比较，miR-515-5p组抑制WT-LINC01354的荧光素酶活性(P<0.05)；miR-NC组与miR-515-5p组MUT-LINC01354的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。如表6所示，pcDNA-LINC01354组miR-515-5p表达低于pcDNA组(P<0.05)；si-LINC01354组miR-515-5p表达高于si-NC组(P<0.05)。

图3 LINC01354序列中含有与miR-515-5p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

表6 LINC01354调控miR-515-5p表达

2.6 抑制LINC01354表达对DU145细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的影响 如图4、表7～8所示，与si-NC组比较，si-LINC01354组细胞LINC01354 mRNA表达和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表达和p21蛋白表达升高(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平降低(P<0.05)，细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数减少(P<0.05)。

注：A为细胞增殖、迁移侵袭相关蛋白表达，B为细胞迁移和侵袭实验(×200)。

2.7LINC01354过表达逆转了毛兰素对DU145细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的作用 如图5、表9～10所示，与毛兰素+pcDNA组比较，毛兰素+pcDNA-LINC01354组细胞LINC01354 mRNA表达和cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高(P<0.05)，miR-515-5pmRNA表达和p21蛋白表达降低(P<0.05)，葡萄糖消耗和乳酸水平升高(P<0.05)，细胞增殖抑制率降低(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数增加(P<0.05)。

表7 抑制LINC01354表达对DU145细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的影响

表8 抑制LINC01354表达对DU145细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

注：A为细胞增殖、迁移侵袭相关蛋白表达，B为细胞迁移和侵袭实验(×200)。

3 讨论

目前，毛兰素的多种药理作用已被阐明，包括抗氧化和抗肿瘤活性[14]。数项研究证明，毛兰素在多种不同的人类癌细胞中均具有突出的抗癌活性，其中包括乳腺癌细胞系T47D，人类肝癌Bel7402和黑色素瘤A375细胞、人类早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人骨肉瘤细胞[15]、宫颈癌HeLa细胞[16]和鼻咽癌细胞系(NPC-039和NPC-BM)[17]等。毛兰素能通过诱导细胞死亡和抑制肺癌细胞中的细胞迁移而发挥抗肺癌活性[18]；毛兰素还能降低肝癌细胞的生存能力，抑制其增殖和迁移，诱导G2/M期阻滞，增强癌细胞凋亡，促进细胞内活性氧水平的增加和线粒体膜电位的降低，并调节肝癌HepG2和SMMC-7721细胞中抗凋亡和促凋亡相关蛋白的表达[19]。然而毛兰素在前列腺癌中的功能与机制仍有待探索。肿瘤细胞中的各种代谢途径(包括糖酵解和核酸，蛋白质或脂质的生物合成)被改变，代表了抗癌治疗的有希望的靶点[20]。本研究方向，各剂量毛兰素均能降低DU145细胞的葡萄糖消耗、乳酸水平、迁移和侵袭细胞数，提高细胞增殖抑制率，并呈剂量依赖性，表明毛兰素具有抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的作用。此外，各剂量毛兰素均降低了cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达，提高了p21蛋白表达，并呈剂量依赖性，进一步证明了毛兰素抗前列腺癌细胞增殖和转移的能力。

lncRNA是一组可以在染色质修饰，转录或转录后水平上调节基因表达的非蛋白质RNA[21]。迄今为止，已报道许多与前列腺癌相关的lncRNA的异常表达，并通过靶向相应的基因来影响前列腺癌细胞的增殖、转移或凋亡[22]。

表9 LINC01354过表达逆转了毛兰素对DU145细胞糖酵解、增殖、迁移和侵袭的作用

表10 LINC01354过表达逆转了毛兰素对DU145细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的作用

LINC01354是lncRNAs的成员，在骨肉瘤组织和细胞中过表达，上调其表达可促进骨肉瘤细胞的侵袭[23]；也在结直肠癌组织和细胞中表达上调，干扰其表达可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移[24]。尽管如此，LINC01354在前列腺癌中的具体作用尚未得到充分解释。本研究首次发现，毛兰素对前列腺癌细胞中LINC01354的表达具有抑制作用。在抑制LINC01354表达后，前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均降低，且葡萄糖消耗和乳酸水平减少，p21蛋白表达升高，表明LINC01354参与前列腺癌的发生发展，抑制其表达有助于抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解。此外，LINC01354过表达后，毛兰素抑制前列腺癌细胞葡萄糖消耗和乳酸水平，增殖、迁移和侵袭，cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的作用均被逆转，其促进p21蛋白表达的作用也被逆转。表明毛兰素可能通过下调前列腺癌细胞中LINC01354的表达，发挥肿瘤抑制功能。

miRNA是长度在20至22个核苷酸之间的非编码RNA分子，在进化中高度保守，主要通过调控下游基因来调节重要的细胞过程[25]。lncRNA被证明通过结合miRNA来调节肿瘤的进程[26]，如LINC00673可以通过充当miR-515-5p的海绵来促进乳腺癌进展[27]。研究发现，miR-515-5p在乳腺癌组织和细胞中下调表达，参与乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭调控[28]。本研究发现，毛兰素以剂量依赖性地促进前列腺癌细胞中miR-515-5p的表达。此外，上调细胞中LINC01354表达时，miR-515-5p表达被抑制；下调LINC01354表达时，miR-515-5p表达被促进。研究还发现，LINC01354过表达逆转了毛兰素促进miR-515-5p表达的作用，表明毛兰素通过LINC01354/miR-515-5p发挥抗前列腺癌作用。

综上所述，毛兰素能够通过调节LINC01354/miR-515-5p表达抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解。因此，毛兰素是一种很有前途的抗癌化合物。