海螵蛸提取物活性成分分析及止血机制

刘书豪， 王有宪， 邵仲柏， 蒋凯俊， 曹联攻， 李 冰， 沈金阳*，刘玮炜*

(1.江苏海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏海洋大学，江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室，江苏 连云港 222005；3.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；4.江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005)

海螵蛸是头足纲乌贼科动物无针乌贼或金乌贼的干燥内壳[1]，分布于浙江、福建、山东等沿海地区。碳酸钙、壳角质与粘液质占其成分含量的90%左右，还含有少量氯化钠、磷酸钙、镁盐等[2-3]。海螵蛸成分构成中成分众多[4]，具有极大的研究开发价值。当前，对海螵蛸的研究多集中于治疗胃溃疡和成骨作用[5-7]，但对凝血止血机制的研究报道较少。郑杰[8]等用黄芪和乌贼骨各30 g，再配伍其他止血药治疗由肾气虚导致的术后出血不止，在服药4剂后出血即止，可见海螵蛸可协同他药发挥止血作用；盛福韶[9]用大黄炭海螵蛸粉，取适量涂于凡士林油纱条上，填塞出血鼻腔，连用7 d，有效率达94.4%。海螵蛸作为一味海洋中药，其良好的凝血效果已被证实，但是其具体止血机制仍不清楚，其止血活性物质也不明确，并且关于其止血作用机制和体外止血研究鲜有报道。因此，本实验对海螵蛸提取物进行体外促凝血检测，探索其活性成分和止血机制。

1 材料

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司)；TDL-40B电动离心机(杭州南开日新生物技术有限公司)；AS-LGJ-10FG冷冻干燥机(郑州宏朗仪器设备有限公司)；ACLTOPT00LAS全自动血凝分析仪(西班牙巴塞罗那沃芬公司)。云南白药(云南白药集团股份有限公司)。新鲜海螵蛸购于连云港新浦区苍梧生活广场，经江苏海洋生物资源与环境重点实验室刘玮炜教授鉴定为金乌贼SepiaesculentaHoyle内壳，粉碎研磨制得。昆明种小鼠饲养于南京中医药大学康达医学院，动物生产许可证号SCXK(苏)2016-0002，动物实验伦理委员会审批号Jou-2020-Y-01-A。

2 方法

2.1 提取物制备

2.1.1 水提物 药材研磨后过40目筛，称取10 g，加去离子水100 mL，室温浸泡6 h，在80 ℃下搅拌热回流2 h[10]，滤过，重复提取1次，合并2次水提液，滤渣超声提取40 min，合并滤液，25 ℃、4 000 r/min离心15 min后取上清，置于60 ℃烘箱中烘干浓缩后，旋转浓缩至近干，冷冻干燥，即得。

2.1.2 醇提物 取药材粉末10 g，加100 mL 95%乙醇浸泡24 h，50 ℃加热回流提取2 h，过滤，滤渣提取1次，超声提取40 min，合并3次滤液，离心后取上清，蒸干，即得。

2.1.3 石油醚提取物 取药材粉末10 g，加100 mL石油醚，室温浸泡[11]一段时间后搅拌2 h，滤过，滤渣用石油醚同法提取1次，超声提取40 min，合并3次滤液，离心后取上清，蒸干，即得。

2.2 活性成分分析 向盛有供试液的试管中或滤纸片上加入相关的化学试剂，根据反应现象(颜色、沉淀等)来判断某种活性成分在海螵蛸提取物中是否存在[12]。

2.3 凝血时间检测 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制备枸橼酸钠抗凝血液，玻璃试管中加入药液0.2 mL(37 ℃水浴预温)，再加入氯化钙溶液0.2 mL，摇匀后于各管内同时加入小鼠抗凝血液0.5 mL，以云南白药为阳性对照，生理盐水为空白对照，置于37 ℃水浴箱中振荡摇晃后立即计时，每5 s轻轻倾斜试管1次，观察有无凝血，到倾斜试管血块凝固于管底而不流动时停止计时，即为凝血时间[13]，重复3次，取平均值。

2.4 凝血四项检测 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制备枸橼酸钠抗凝血液(1份抗凝液+9份全血)，轻轻颠倒混匀，3 000 r/m离心15 min，收集上清液。取待测血浆0.1 mL，分为醇提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)剂量组，水提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)剂量组，石油醚提取物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)剂量组，云南白药(2.0 mg/mL)组，加入0.05 mL样品，另设阴性对照组，加入0.05 mL生理盐水，混匀，置于全自动血凝分析仪上，检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APPT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)水平，重复6次，取平均值。

3 结果

3.1 成分分析 由表1可知，海螵蛸提取物可能含有甾体三萜类、挥发油和油脂、皂苷、有机酸、内酯、香豆素、糖类、氨基酸，未发现蛋白质、蒽醌类、酚类、鞣质等成分。

表1 提取物成分分析结果

3.2 提取物对小鼠凝血时间的影响 由表2可知，与空白组比较，水提物组凝血时间缩短(P<0.05)，接近阳性对照组。

表2 提取物对小鼠凝血时间的影响

3.3 提取物对小鼠凝血四项的影响 由表3可知，与空白组比较，水提物各剂量组小鼠PT、APPT缩短(P<0.05)，并呈剂量依赖性，但各提取物组TT、FIB水平均无明显变化(P>0.05)。

表3 提取物对小鼠凝血四项的影响

4 讨论

体外止血实验表明，海螵蛸提取物中水提物体外促凝效果良好，其活性成分中有良好的体外促凝物质。海螵蛸主要促凝血成分为Ca离子、甲壳素、壳聚糖和提取物多糖[1]，其中甲壳素不溶于水，壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，海螵蛸中Ca离子存在形式为其主要成分CaCO3，并且难溶于水，推测活性成分可能为提取物多糖。凝血过程是一系列的酶促反应，包括内源性、外源性、共同凝血3个途径，使血浆纤维蛋白原变为纤维蛋白，血液由溶胶状态变为凝胶状态[14]。凝血四项检测结果表明，海螵蛸水提物能缩短小鼠PT、APTT，高剂量下更明显，但TT、FIB基本无变化，其促凝血作用可能与外源性凝血途径和内源性凝血途径中影响凝血因子有关，同时其质量浓度提高时可积极影响内源性凝血中促进凝血活酶形成过程中凝血因子、激肽释放酶原的过程。