基于转录组学与网络药理学研究补阳还五汤治疗心力衰竭的机制

石志坚， 鲁文涛， 张军鹏， 郑 轶

(郑州市中医院，河南 郑州 450007)

心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段，是心脏结构或功能的异常[1]。在过去的十年中，心血管疾病是全球主要的死亡原因之一，严重威胁着人类的生命和健康[2]。目前全世界约有2 600万人患有心力衰竭，美国和欧洲的心力衰竭年发病率超过100万[3]。中国有超过450万名心力衰竭患者，35～74岁成年人的患病率为0.9%[4]。由于衰老、高血压、糖尿病等多种心力衰竭危险因素和人口老龄化不断增加，心血管疾病死亡率占中国全因死亡人数的40%以上，并且这一数字正在迅速增加[5-6]。近20年来，心力衰竭药物治疗的概念发生了很大变化，从改善血流动力学的角度到生物学调整，各种新的治疗方法和优化的心力衰竭管理方法不断被提出。尽管取得了不少进展，但目前心力衰竭的患病率和死亡率仍然很高。

补阳还五汤主要由赤芍、桃仁、黄芪、红花、当归、川芎和地龙组成，具有活血化瘀、补气通络的功效。荟萃分析显示，相对于单纯西药治疗，补阳还五汤能够有效改善患者症状，提高心脏射血分数[7]。但中药方剂成分复杂的因素限制其具体起效机制及起效成分的揭示。因此，本研究借助转录组学与网络药理学，对补阳还五汤干预心力衰竭的网络化机制进行分析，并设计动物实验对其进行验证，为后续研究提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 转录组数据 根据关键词“heart failure”在GEO数据库进行搜索，选择物种为“Musmusculus”，结果选取GSE5500数据集，从中选取假手术组大鼠心脏样本5例，以及主动脉缩窄环植入(TAC)手术造模的心衰大鼠心脏样本6例。使用R语言“limma”程序包[8]对芯片信息进行矫正并注释，按照logFC≥1，Pvalue<0.05标准进行二次差异分析以获取明显差异基因，“clusterProfiler”程序包对明显差异基因进行基因本体(GO)富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析，“ggplot”程序包对差异分析结果进行可视化操作。

1.2 核心药物有效成分及靶点获取 在TCMSP数据库中进行检索，获取补阳还五汤药物的有效成分及靶点，根据ADME原则以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准进行筛选。由于TCMSP网站未收录“地龙”，故采用文献检索法获取其有效成分及靶点。将靶点全称输入到Uniprot网站(https://www.uniprot.org/)，转化为相应基因简称。

1.3 疾病-药物交集靶基因与PPI网络构建 将上述心力衰竭差异基因与补阳还五汤靶基因进导入到Draw Venn Diagram网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中绘制韦恩图，得到疾病-药物交集靶基因。将交集靶基因导入到STRING网站(https://string-db.org/)进行蛋白质互作(Protein protein interaction，PPI)网络分析，并利用Cytoscape软件中的cytohub插件获取度值前10的靶点。

1.4 GO/KEGG富集分析与药理网络构建 将上述交集基因导入到David数据库中进行GO/KEGG富集分析，根据富集结果利用R语言进行可视化操作，将其与上述转录组差异基因富集结果进行比对，结合前期文献研究结果，选取apoptosis(细胞凋亡)信号通路进行验证。将上述信息进行汇总，导入到Cytoscape软件构建补阳还五汤治疗心力衰竭的药物-成分-靶点-通路网络图。

1.5 动物实验

1.5.1 试剂与药物 黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁购自河南省中医院中药饮片室，经郑州市中医院主管中药师李玉芬鉴定为正品，将上述药材等比例合并后在100 ℃下煎煮0.5 h，取过滤液，配制成每1 mL含2 g生药的浓缩液。血清肌酸激酶同工酶CKMB(批号BS-0649R)、肌钙蛋白I(cTnI，批号WO118)、肌红蛋白(Myo，批号K12868)、B型脑钠肽(BNP，批号D3462)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；caspase-8(批号2020N2BC1034)、caspase-3(批号2020N2AW1260)、PARP(批号2020A1HN1367)蛋白抗体均购自上海中韬生物科技有限公司。

1.5.2 分组与给药 SPF级雄性大鼠30只，体质量(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2020-0011，适应性饲养7 d后随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组，每组10只，给予清洁自来水和标准饲料，自由进食饮水，饲养条件为温度22～24 ℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h明暗交替。手术前禁食，模型组和补阳还五汤组大鼠按照TAC法进行主动脉缩窄环置入，术后24 h死亡7只，3组分别存活8、7、8只，其中补阳还五汤组灌胃给予补阳还五汤药液，按人体表面积计算给药量为10 mL/kg，干预28 d。本研究方案已通过河南中医药大学实验动物伦理委员会审核并批准(编号DWLL202103067)，并在实验过程中严格遵守动物伦理学3R原则。

1.5.3 心功能指标检测 大鼠末次灌胃给药12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，检测左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(LVFS)、左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)。

1.5.4 血清生化指标检测 大鼠内眦静脉丛取血并分离心脏，3 000 r/min离心10 min后取上清，严格按照试剂盒说明书进行操作，采用全自动化仪检测血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平。

1.5.5 HE染色 甲醛固定大鼠心脏组织，进行脱水、包埋、切片、脱蜡等操作，HE染色观察其病理变化。

1.5.6 Western Blot法检测相关蛋白表达 取适量冷冻的大鼠心脏组织于冰上剪碎，加蛋白裂解液进行裂解，离心取上清，采用BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，乙酸纤维素转膜，加入稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加ECL显示剂显色，暗室胶片曝光。采用Image J软件对蛋白条带进行量化处理，目标蛋白表达量通过β-actin校正。

2 结果

2.1 基因芯片差异基因 芯片批次矫正结果见图1A，中线在同一水平，符合差异分析要求。共获得心力衰竭差异基因20 700个，其中明显差异基因共401个，包括上调基因319个，下调基因82个，见图1B，红色代表上调基因，绿色代表下调基因，黑色为其他差异基因。图1C纵坐标为前50个差异基因，横坐标代表不同样本。

2.2 明显差异基因GO/KEGG富集分析 GO富集分析显示，心力衰竭病理机制主要涉及regulation of cell development(细胞发育的调控)、proteasomal protein catabolic process(蛋白酶体蛋白质分解代谢过程)等生物过程；cell-cell junction(细胞-细胞连接)、neuronal cell body(神经元细胞体)、presynapse(突触前)等细胞组分；与GTPase regulator activity(GTP酶调节活性)、ATPase activity(ATP酶活性)、transcription coregulator activity(转录协同调节活性)等分子功能，见图2。KEGG分析主要富集到MAPK、Ras、PI3K-Akt、神经变性疾病等信号通路，见图3。

2.3 补阳还五汤与心力衰竭交集靶基因 中药有效成分分别为赤芍28种，桃仁2种，黄芪20种，红花22种，当归2种，川芎7种，地龙18种，主要包括ellagic acid(鞣花酸)、paeoniflorin(芍药苷)、isorhamnetin(异鼠李素)、formononetin(芒柄花素)、calycosin(花萼素)、quercetin(槲皮素)、baicalin(黄芩苷)、luteolin(木犀草素)，靶基因去重后共192个，交集靶基因共177个，见图4。

2.4 PPI网络与GO/KEGG分析 靶基因的蛋白质互作网络见图5，越靠近中心的度值越高，颜色也越偏红色，其中度值排名前10的为ALB、IL6、caspase-3、MAPK8、MYC、JUN、VEGFA、EGFR、HSP90AA1、ESR1，度值分别为77、74、72、72、68、67、66、66、64、61，见图6。GO富集分析主要涉及response to steroid hormone(对类固醇激素的反应)、response to oxidative stress(对氧化应激的反应)、response to drug(对药物的反应)等生物过程；transcription regulator complex(转录调节复合物)、membrane microdomain(膜微区)、membrane raft(膜筏)等细胞组分；ubiquitin-like protein ligase binding(泛素-类蛋白连接酶结合)、RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding(RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合)、DNA-binding transcription factor binding(脱氧核糖核酸-结合转录因子结合)等分子功能，见图7。KEGG分析主要涉及lipid and atherosclerosis(脂质与动脉粥样硬化)、fluid shear stress and atherosclerosis(流体剪切应力与动脉粥样硬化)、apoptosis(细胞凋亡)、TNF signaling pathway(肿瘤坏死因子信号通路)等信号通路，见图8。

2.5 细胞凋亡信号通路与待验证靶点 细胞凋亡信号通路见图9，红色节点为所富集到的靶点，其中caspase-8可上调caspase-3表达，进而抑制PARP的保护作用来激活细胞凋亡进程；在KEGG富集结果中，与心力衰竭发生较为相关并具有前期文献支撑的为细胞凋亡信号通路，同时在HUB基因中caspase-3的度值较高，故本研究选取这3个主要靶点用于后续动物实验验证。

2.6 补阳还五汤干预心力衰竭的网络机制 网络机制图见图10，相互联系的节点以线连接，其中褐色椭四边形代表方剂，绿色六边形代表中药，黄色六边形代表有效成分，蓝色圆形代表靶基因，红色V形代表信号通路，紫色四边形代表疾病，可知补阳还五汤从多成分、多靶点、多通路干预心力衰竭。

2.7 动物实验

2.7.1 补阳还五汤对大鼠心功能指标的影响 3组大鼠基础体质量、体长等参数基本一致，造模完成后，模型组、补阳还五汤组大鼠行动迟缓，不喜活动。末次给药24 h后，与假手术组比较，模型组大鼠LVIDs、LVIDd升高(P<0.05)，LVEF、LVFS降低(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组大鼠LVIDs、LVIDd降低(P<0.05)，LVEF、LVFS升高(P<0.05)，见表1。

表1 补阳还五汤对大鼠心功能指标的影响

2.7.2 补阳还五汤对大鼠血清生化指标的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平升高(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 补阳还五汤对大鼠血清生化指标的影响

2.7.3 补阳还五汤对大鼠心肌组织病理形态的影响 假手术组大鼠可见心肌细胞排列紧密整齐，结构正常，无炎性浸润和坏死，无间质水肿；模型组大鼠可见心肌纤维排列紊乱、呈条索状改变，心肌细胞变性、水肿，横纹消失，部分细胞核溶解，心肌间质明显水肿、疏松，出现明显炎性浸润和坏死灶；补阳还五汤组大鼠心肌细胞排列较为整齐，结构大致正常，心肌细胞变性、水肿明显减轻，横纹有所恢复，细胞核完整且大致处于细胞中央，间质水肿明显减轻，可见部分新生细胞，见图11。

2.7.4 补阳还五汤对大鼠心脏组织caspase-8、caspase-3、PARP蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心脏组织caspase-8、caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)，PARP蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组大鼠心脏组织caspase-8、caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)，PARP蛋白表达升高(P<0.05)，见图12。

3 讨论

补阳还五汤是中医经典方剂，临床上主要用于中风之气虚血瘀证，而其在心血管疾病方面的治疗作用被大大低估。心力衰竭归属于中医药学“心悸、水肿、喘证、痰饮”等范畴[9]。现代研究表明心力衰竭的发生除了与冠脉供血不足有关外，微循环障碍也是导致心肌重构的重要原因[10]。补阳还五汤中黄芪为君药以补气利水，伍之赤芍、桃仁、红花、川芎等药活血化瘀，另有地龙一药具备通络之功，符合中西医心力衰竭发病之机。芍药苷预处理对大鼠心肌缺血后再灌注损伤具有保护作用，减轻心梗后心力衰竭症状，其机制与抑制细胞凋亡相关信号通路的表达进而减少氧化应激和细胞凋亡有关[11]；槲皮素作为一种植物成分，体内外和临床研究均表明其具有心脏保护作用[12-13]；黄芩苷可改善慢性炎症、免疫失衡、脂质代谢紊乱、细胞凋亡和氧化应激[14]。

中药起效成分与作用机制复杂，网络药理学作为传统“还原主义”药物研究策略的补充与完善，对揭示中药方剂多成分、多靶点、多通路的多层次作用具有重要意义[15]。通过对疾病与药物的交集靶基因进行GO/KEGG富集分析，发现补阳还五汤能够从多个细胞组分、分子功能、生物过程干预心力衰竭，涉及到多个信号通路。氧化应激下，细胞膜和脂蛋白中含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的磷脂和胆固醇酯很容易通过自由基诱导脂质过氧化(LPO)，形成复杂的氧化产物，进而导致冠脉狭窄及心肌供血供氧不足加剧[16]。TNF、IL6、IL17等促炎细胞因子合成和分泌的增加是心力衰竭发展的主要标志[17]。肿瘤坏死因子(TNF)-α或Fas配体(FasL)等与其受体结合以激活caspase-8，可导致线粒体释放细胞色素C，从而激活caspase-9，两者可共同调节一系列下游靶点，包括caspase-3、PARP等[18]。同时，在HUB基因中caspase-3的度值较高，因此，本研究通过动物实验对这caspase-8、caspase-3和PARP这3个靶点进行验证。

由于在预实验中采用传统用药比例并未取得预期疗效，而“分子配伍”或者“分子处方”这一概念早已有之，即在分子水平，通常从入血成分上去研究中药有效成分，建立组效关系，优化有效分子配伍处方比例[19-21]，故而初步采用等比例配伍进行实验。研究发现，补阳还五汤能升高大鼠心脏LVIDd、LVIDs，降低LVEF、LVFS，并改善血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平，表明其对大鼠心功能改善作用明显，并能增加心肌供血供氧。通过观察大鼠心脏组织病理学，发现补阳还五汤组心肌细胞排列较为整齐，结构大致正常，心肌细胞变性、水肿明显减轻，横纹有所恢复，表明其对心肌重构的改善效果明显。Western Blot检测结果显示，补阳还五汤能够增加caspase-8、caspase-3蛋白表达，并降低PARP蛋白表达，表明可能对细胞凋亡具有抑制作用。

综上所述，本研究通过转录组学和网络药理学分析，发现补阳还五汤可能通过调节细胞凋亡等信号通路，从而发挥干预心力衰竭的作用。通过动物实验进行验证，发现补阳还五汤可以有效改善大鼠心功能，并调节细胞凋亡信号通路上的多个靶蛋白表达。