黄芪甲苷通过调控Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路对输血相关性急性肺损伤大鼠的改善作用

唐龙泉， 傅 梅， 龚晓玲， 王文俊， 肖 昆*

(1.江西省抚州市第一人民医院，江西 抚州 344000；2.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

急性肺损伤及其重症形式急性呼吸窘迫综合征是发生在肺部的一种重症炎症反应，严重者会因呼吸功能受到抑制而危及生命，患者的肺泡会出现损坏，肺部没有足够的气流进入，进一步导致血液中氧含量严重不足，与此同时，患者肺部还会出现炎症导致的水肿[1-2]。许多因素可以引起急性肺损伤，例如脓毒症、脂多糖刺激及输血相关的外伤等[3]。其中输血相关性急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury, TRALI)是指使用与血液有关制品后引起的肺组织急性损伤, 发病迅速, 致死率高,但临床尚无可靠的治疗方法[4-5]。黄芪具有抗氧化、消炎以及扩张血管等作用，其有效成分对肺损伤有一定的治疗作用。黄芪甲苷是黄芪的有效成分[6-8]，其对输血相关性急性肺损伤的作用机制尚未有相关文献报道。Wnt/β-catenin通路在受损的组织复原、伤口愈合、组织纤维化等中起着重要作用[9-10]；JAK2/STAT3通路是细胞中不可缺少的信号转导通路,它能够调控细胞分裂、凋亡和炎症因子等表达[11-12]。本研究基于Wnt-β-catenin/JAK2-STAT3信号通路，探讨黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠的保护作用，以期为输血相关性急性肺损伤的治疗提供参考。

1 材料

1.1 动物 48只6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，购自广东省医学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2018-0002, 实验动物使用许可证号SYXK(粤)2018-0002，饲养于标准动物饲养间。

1.2 试剂与药物 黄芪甲苷对照品(纯度≥98%，批号MUST-09102301)购自上海源叶生物科技有限公司；地塞米松(批号100129-200303)购自湖北纽兰药业有限公司。LPS(批号L4391-1MG)购自上海源叶生物科技有限公司；Wnt5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗体(批号bs-1948R、AG763、AG751、71-2700、3776、74987、9145、9139)购自美国Proteintech公司；蛋白、mRNA裂解液(批号G1120、C1053)购自上海泛思生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、化学发光底物、HE染色液(批号23227、BL520B-1、WH1144)购自美国OriGene公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 血浆 2019年2月随机选择无偿献血者AB型全血10 U(1 U含全血200 mL及CPDA保存液30 mL)，无菌条件下分别留取血样10份(10 mL/份)，存储21 d，830×g离心5 min，获得血浆约6 mL/份，分装6份(1 mL/份)，于-80 ℃保存备用。输注前将血浆于56 ℃水浴30 min。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 大鼠随机分为正常组、模型组、黄芪甲苷组和阳性药组，每组12只。除正常组外，其余各组大鼠均建立输血相关性急性肺损伤模型[13]，腹腔注射2 mg/kg LPS，2 h后麻醉，在股血管处插管，用注射器抽出1 mL血液，再输注1 mL AB型人血浆，正常组大鼠抽出血液后输注1 mL 0.9% NaCl。模型建立后，黄芪甲苷组腹腔注射黄芪甲苷(50 mg/kg，用0.9% NaCl溶液配置成1 mL黄芪甲苷注射液)，阳性药组腹腔注射地塞米松(50 mg/kg)，正常组和模型组腹腔注射等体积0.9% NaCl，24 h后处死大鼠，取血和肺组织用于各指标检测。

2.2 肺组织湿干质量比检测 将分离的肺组织用PBS洗涤后称定质量，记作湿质量WA；随后将肺组织放入80 ℃烤箱烘烤至恒重再次称定质量，记作干质量WB，肺组织湿干质量比=(WA/WB)×100%。

2.3 部分动脉氧分压(PaO2)检测 通过一次性注射器采集大鼠动脉血0.2 mL,采用血气分析仪ABL90，按照产品说明书进行检测。

2.4 HE染色观察肺组织病理形态 各组大鼠肺组织用10%中性甲醛固定后石蜡包埋切片，经HE染色后光镜下(×200)观察拍照。HE染色病理评分标准为1分，无肺泡炎;2分，小于20%的视野呈现肺泡炎; 3分，21%～50%视野呈现肺泡炎;4分，超过半数视野呈现弥漫性肺泡炎。

2.5 免疫组织化学染色分析Wnt5a蛋白表达 大鼠肺组织石蜡切片经脱蜡后进行抗原修复，3% H2O2孵育10 min，滴加血清室温封闭1 h，滴加一抗(1∶50)4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加辣根酶标记二抗室温孵育1 h，PBS冲洗，DAB显色，显微镜拍摄肺泡上皮细胞，每张切片选择5个视野(×200)，空白对照采用抗体稀释液代替一抗。

2.6 Western blot法检测β-catenin、GSK-3β、JAK2、STAT3蛋白表达 蛋白裂解液裂解肺组织，12 000 r/min离心10 min，取上清液即得总蛋白，BCA法进行蛋白定量，将蛋白与上样缓冲液混合后于100 ℃煮沸5 min，蛋白样品采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离，随后转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(β-catenin、GSK-3β、JAK2、STAT3)4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加入带有辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBS洗涤，使用化学发光液进行显色，成像系统上进行曝光，分析条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.7 RT-qPCR法检测Axin2、CyclinD1、KLF4、VEGFmRNA表达 取出大鼠肺组织，按TRIzol试剂盒说明书进行裂解并提取总RNA，并按说明书将其反转录成cDNA。在冰上配置50 μL PCR扩增反应体系，即2×SYBR 25 μL、正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL、双蒸水20.7 μL、Taq DNA Polymerase 0.3 μL，于在PCR仪上反应，条件为预孵育95 ℃ 120 s；扩增95 ℃ 20 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠肺组织湿干质量比的影响 如表2所示，模型组大鼠肺组织湿干质量比高于正常组(P<0.05)；黄芪甲苷组及阳性药组大鼠肺组织湿干质量比低于模型组(P<0.05)。

表2 黄芪甲苷对大鼠肺组织湿干质量比的影响

3.2 黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠动脉氧分压的影响 如表3所示，模型组大鼠动脉氧分压低于正常组(P<0.05)；黄芪甲苷组及阳性药组大鼠动脉氧分压高于模型组(P<0.05)。

表3 各组大鼠动脉氧分压比较

3.3 黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠肺组织病理形态的影响 如图1、表4所示，正常组大鼠肺组织肺泡结构比较清晰，未发现充血、炎症细胞浸润、水肿等病理现象；与正常组比较，模型组大鼠肺组织有较大程度的出血，肺泡腔里有大量炎性细胞浸润，出现了明显的肺水肿，肺泡间隔也有所加宽，病理评分升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪甲苷组大鼠肺泡壁增厚程度较轻，有少量充血，阳性药组病变程度有所改善，病理评分降低(P<0.05)。

表4 各组大鼠肺组织病理评分比较

3.4 黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠肺组织Wnt5a蛋白表达的影响 如图2、表5所示，正常组大鼠肺组织Wnt5a蛋白阳性表达较低；与正常组比较，模型组Wnt5a蛋白阳性表达增加(P<0.05)；与模型组比较，黄芪甲苷组及阳性药组Wnt5a蛋白阳性表达降低(P<0.05)。

表5 各组大鼠肺组织Wnt5a蛋白阳性表达比较

示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织p-GSK-3β、p-JAK2、p-STAT3、β-catenin表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪甲苷组和阳性药组大鼠肺组织p-GSK-3β、p-JAK2、p-STAT3、β-catenin表达均降低(P<0.05)。

3.6 黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤大鼠肺组织Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路相关靶基因mRNA表达的影响 如图4所示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织Axin2、KLF4、CyclinD1、VEGFmRNA表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，黄芪甲苷组及阳性药组大鼠肺组织Axin2、KLF4、VEGFmRNA表达降低(P<0.05)，CyclinD1 mRNA表达升高(P<0.05)。

4 讨论

在当今学说中，“二次打击”被认为是造成输血相关性急性肺损伤的重要原因，第一次打击是患者伴有重大感染等情形可以导致中性粒细胞的活化，从而使其能躲藏在肺里；第二次打击是将含白细胞抗体的血液输注到患者体内，其中的白细胞抗体和患者体内的白细胞产生了抗原-抗体免疫反应，使患者的补体和肺微血管内皮细胞Fcγ受体被激发，导致中性粒细胞的进一步活化，给肺血管内皮细胞造成沉重打击，改变其通透性，使得血管中的物质更容易进入肺泡及肺泡间质，导致肺水肿，呼吸膜加厚，引起各时间点氧气进入血液中的含量不一致，最终的结果便是导致输血相关性急性肺损伤[14-15]。在上述理论的指导下，大鼠腹腔注射低剂量LPS，营造一种中性粒细胞在肺循环中激活的状态，模拟患者输血后肺部损伤的情况，建立输血相关性急性肺损伤大鼠模型，建模后24 h检测大鼠肺部病理特征、肺组织湿干质量比和PaO2。结果，模型组大鼠肺组织湿干质量比增加，PaO2降低，肺组织有不同程度的肺泡结构被损坏、肺间质变宽、肺水肿及炎症细胞浸润等表现；给予黄芪甲苷后，大鼠肺水肿及损伤情况有所缓解。

研究表明，Wnt-β-catenin/JAK-STAT信号通路对机体不同生理过程都有一定的影响[16-19]。当发生了肺损伤时，Wnt信号的过度激活或许会引起胞外物质的大量释放，导致肺组织的纤维化，也可以促进肺上皮细胞的过度增殖[20]。JAK-STAT通路可以参与目的基因的转录以及炎症因子的表达[21]。本研究发现，Wnt-β-catenin通路的配体Wnt5a参与到了黄芪甲苷治疗输血相关性急性肺损伤的过程中，与此同时，Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路胞内分子GSK-3β、JAK2以及STAT3的磷酸化和β-catenin表达也参与到该过程中。本研究还发现，黄芪甲苷组Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路的靶基因Axin2、KLF4及VEGFmRNA表达均降低，CyclinD1 mRNA表达升高。

综上所述，本研究初步解释了黄芪甲苷对输血相关性急性肺损伤的改善作用是通过抑制Wnt5a表达，降低GSK-3β、β-catenin、JAK2、STAT3蛋白磷酸化及提高Wnt-β-catenin/JAK-STAT信号靶基因的表达得以发挥的，提示促进Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路的活化或许能够成为治疗输血相关性急性肺损伤的新手段。