交泰丸水提液中小檗碱及其单体在大鼠体内药动学比较

杨欣怡， 戴国梁， 陈闪闪， 贾可可， 欧阳冰琛， 居文政

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

交泰丸出自明代《韩氏医通》，由黄连、肉桂组成，方名出自清代王士雄的《四科简要方·安神》[1]。现代研究表明，交泰丸配伍比例以黄连-肉桂(10∶1)时抗抑郁效果最好[2]。课题组前期研究发现，交泰丸主要成分有表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、肉桂醛等，其中盐酸小檗碱含量最高[3]。

近年来，小檗碱因其在镇静催眠[4]、神经保护[5]等方面的生理活性被广泛关注，但单体存在水溶性和口服吸收差、生物利用度低等不足[6]。目前，对小檗碱药动学的研究大多集中在口服单体小檗碱[7]或含有小檗碱的中药提取物(如黄连、黄柏[8-9]等)，而对于两者的对比研究较少。近年来，受中医学说启发，对中药成分相互作用的研究较多，课题组前期考察交泰丸中小檗碱药动学与其他共存成分的关系，从物质基础层面提出可有效增强该成分生物利用度的方法。

本实验通过灌胃给予健康大鼠交泰丸水提液、小檗碱单体，建立高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测小檗碱血药浓度，从而比较该成分药动学，为交泰丸配伍理论和临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪、Quattro Premier三重四级杆质谱仪，配置电喷雾化离子源(ESI)、色谱工作站Masslynx 4.0(美国Waters公司)；AE240电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；MICRO-17R冷冻离心机(美国Thermo公司)；WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；A10超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与药物

1.2.1 交泰丸水提液 黄连(批号20200801-01)、肉桂(批号20200801-01)饮片均购自贵州同德药业股份有限公司，经江苏省中医院药学部副主任中药师张倩鉴定为正品。根据课题组前期报道的方法[10]自制交泰丸，其水提液质量浓度为1.1 g/mL(即每1 mL药液含1.1 g原药材)，小檗碱含量为56.76 mg/mL[3]，置于冰箱中备用。

1.2.2 小檗碱混悬剂 取一定量小檗碱片(成都锦华药业有限责任公司，批号200704，0.1 g/片)，称取总质量后计算平均片重，于研钵中研成细粉，精密称取适量，0.5% CMC-Na溶液配成混悬剂(小檗碱含量为56.76 mg/mL)，置于冰箱中备用。

1.2.3 试剂 小檗碱(批号MUST-16031814，纯度98.95%)、延胡索乙素(批号MUST-16030905，纯度98%)对照品均购于曼斯特(成都)生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 动物 12只SPF级SD雄性大鼠，体质量(170±10)g，购自南通大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(苏)2019-0001。动物实验经南通大学实验动物伦理委员会审查通过(编号2021DW-17-01)。

2 方法

2.1 LC-MS/MS分析条件

2.1.1 色谱 Agilent ZOBAX SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%甲酸(45∶55)；体积流量0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)；喷雾电压3 000 V；离子源温度350 ℃；正离子检测；小檗碱m/z336.0～320.0(锥孔电压40 V，碰撞电压30 V)；内标(延胡索乙素)m/z356.1～191.9(锥孔电压30 V，碰撞电压32 V)。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取小檗碱对照品适量，甲醇溶解定容，制成质量浓度为1.38 mg/mL的溶液，精密吸取适量，甲醇依次稀释至4.49、6.74、13.48、26.95、53.91、107.81、215.63 ng/mL，精密吸取适量，甲醇进一步稀释至11.32、33.97、169.85 ng/mL，即得。

2.2.2 内标溶液 精密称取延胡索乙素对照品适量，甲醇溶解定容，制成质量浓度为1.17 mg/mL的溶液，精密吸取适量，甲醇稀释至4.82 ng/mL，即得。

2.3 血浆样品处理 将冷冻保存的血浆样品在室温下解冻，短暂涡旋混合，精密吸取50 μL空白血浆或含药血浆至1.5 mL EP管中，依次加入内标、对照品溶液(含药血浆更换为纯甲醇)各10 μL，涡旋混匀30 s，加入150 μL乙腈，振荡3 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液10 μL至具内衬管的进样瓶中，进行LC-MS/MS分析。

2.4 分组、给药与采血 大鼠按体质量均衡和随机的原则分为交泰丸组和小檗碱组，每组6只，实验前禁食12 h，自由饮水，分别灌胃给予交泰丸水提液3 g/kg、小檗碱混悬剂154.8 mg/kg(以小檗碱计，与交泰丸水提液给药量保持一致)，于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h眼球后静脉丛采血各0.3 mL，置于1.5 mL肝素化试管中，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上层血浆，保存于-80 ℃冰箱中。

3 结果

3.1 专属性试验 取空白大鼠血浆、空白大鼠血浆+对照品+内标、交泰丸水提液给药5 min后血浆样品适量，按“2.3”项下方法处理，在“2.1”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，小檗碱、内标保留时间分别为2.17、1.91 min，两者分离度和峰形良好，无内源性干扰，表明该方法专属性良好。

3.2 线性关系考察 取50 μL空白大鼠血浆，加入对照品、内标溶液各10 μL，按“2.3”项下方法处理，在“2.1”项条件下进样测定。以小檗碱质量浓度为横坐标(X)，小檗碱、内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=0.019 26X+0.001 028(r=0.998 2)，在0.90～43.13 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为0.90 ng/mL。

3.3 精密度、准确度试验 取50 μL空白大鼠血浆，按“2.3”项下方法处理，制成定量下限及低、中、高质量浓度质控样品(分别含0.9、2.26、6.79、33.97 ng/mL小檗碱)，在“2.1”项条件下进样测定3次，结果见表1，可知该方法精密度、准确度良好。

表1 小檗碱精密度、准确度试验结果

3.4 基质效应试验 精密吸取低、高质量浓度对照品溶液及内标溶液各10 μL，依次加入纯水50 μL、乙腈150 μL，涡旋3 min，吸取50 μL，在“2.1”项条件下进样测定，记录小檗碱峰面积(As)C、内标峰面积(Ai)C及其平均值-(As)C、-(Ai)C(n=6)，按“2.3”项下方法提取空白血浆溶液(不加内标)，离心后同法操作，计算两者基质效应因子MFs、MFi及内标归一化后基质效应因子MF，公式分别为MFs=[As/-(As)C]×100%、MFi=[Ai/-(Ai)C]×100%、MF=(MFs/MFi)×100%，计算RSD，结果见表2。由此可知，血浆中小檗碱基质效应均小于15%，符合生物样品分析要求。

表2 小檗碱基质效应试验结果

3.5 提取回收率 取50 μL空白大鼠血浆，按“2.3”项下方法处理，制成低、中、高质量浓度质控样品，在“2.1”项条件下进样测定，记录小檗碱峰面积(As)B、内标峰面积(Ai)B。按“3.4”项下方法处理，得到空白血浆溶液，加入不同质量浓度对照品溶液及内标溶液各10 μL，再加入空白血浆200 μL，涡旋混匀3 min，吸取50 μL，在“2.1”项条件下进样测定，记录两者峰面积(As)A、(Ai)A及其平均值-(As)A(n=6)、-(Ai)A(n=18)，计算提取回收率Recs、Reci，公式分别为Recs=[(As)B/-(As)A]×100%、Reci=[(Ai)B/-(Ai)A]×100%，结果见表3。

表3 小檗碱、内标提取回收率试验结果

3.6 稳定性试验 取50 μL空白大鼠血浆，按“2.3”项下方法处理，制成低、高质量浓度质控样品，分别在室温下放置6 h、-80 ℃下放置60 d、反复冻融3次、-20 ℃下放置72 h、自动进样器中放置24 h后，在“2.1”项条件下进样测定，结果见表4。由此可知，小檗碱稳定性良好，符合生物样品分析要求。

表4 小檗碱稳定性试验结果

表5 小檗碱主要药动学参数

4 讨论

小檗碱与表小檗碱为同分异构体，由于两者具有相同的母离子和子离子，在质谱检测上共用一个离子通道，故需在色谱上将其进行分离。本实验选择了流动相乙腈-0.2%甲酸(45∶55)，体积流量0.25 mL/min，在该检测条件下，2个同分异构体能很好地分离，不影响小檗碱的检测。再比较了0.1%、0.2%、0.3%甲酸，发现0.2%甲酸作为流动相时，小檗碱的响应最强，峰形最优。

本研究对交泰丸水提液和小檗碱单体在相同条件下进行对比研究，结果表明，两者药动学行为存在明显差异。从图2中可以看出，大鼠灌胃给予小檗碱单体时，在达到峰浓度后随即大幅下降，而且血药浓度长期处于较低水平，与文献[6]报道基本一致；交泰丸水提液组在达到峰浓度后并未立刻大幅下降，而是维持在较高浓度水平。大鼠灌胃给予交泰丸水提液后，与口服等量小檗碱单体比较，其曲线下面积AUC0-t及末端消除半衰期t1/2分别提高了1.23、1.28倍，提示以交泰丸水提液的方式给药，小檗碱的生物利用度更高。正如中药复方中的药辅共生理论[11]，辅药在药方中未必起治主症的作用，但却可使君药的吸收增大，消除速率减慢，表观生物利用度提高。有研究表明，肉桂能提高黄连小檗碱的的生物利用度，黄连粉末中其他成分也可能对小檗碱的吸收和代谢发挥着积极影响，提示交泰丸水提液中其他化学成分的相互作用可能是使小檗碱生物利用度增加的原因[12]。另外，2组血药浓度-时间曲线均出现双峰现象，表明小檗碱在吸收过程中会受到肝肠循环的影响，与文献[13]报道一致。

交泰丸具有交通心肾、镇静安神的作用，临床上常用于治疗失眠[14]、抑郁症[15]。研究表明，交泰丸中小檗碱可以穿过血脑屏障进入海马组织发挥作用，减少小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中不动的时间，并能使全脑中去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的含量增加，从而起到类似于地昔帕明、麦普替林、氟西汀等药物的抗抑郁作用[16]。小檗碱是交泰丸主要成分，也具有抗抑郁的疗效[17-18]，其体内药动学可能会影响到交泰丸发挥抗抑郁的效果。本研究后续会进一步开展交泰丸水提液、单体小檗碱在慢性温和不可预见性应激抑郁大鼠模型中抗抑郁效果的比较研究，以期为临床抗抑郁治疗的合理用药提供数据参考。