ICP-MS法结合OPLS-DA鉴别6种鹿茸

周 强， 袁明昊， 曾 彬， 魏霭玲， 周 涛， 雷苛露， 叶 强， 郭 力

(成都中医药大学药学院，西南特色资源国家重点实验室，四川 成都 611137)

鹿茸是传统名贵中药，为鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck或马鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿尚未骨化的幼角[1]，含有氨基酸、多肽、多糖、核苷、激素、无机元素等成分[2-3]，在骨骼系统、神经系统、心血管系统、免疫系统方面均有良好疗效[4-5]，但市场上有用驯鹿茸、狍鹿茸、花马杂交鹿茸充当梅花鹿茸、马鹿茸，甚至用马鹿茸充当梅花鹿茸，这种以假乱真、以次充好的现象严重，导致鹿茸质量难以控制[6-7]。课题组前期采用分子生物学技术鉴别手段[8]鉴定出6种鹿茸，鹿茸中含有丰富的有机、无机成分[9-15]，但尚无有以无机元素为指标进行鉴别的报道。因此，本实验采用灵敏度高、测定速度快、谱线简单、干扰较少的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定49批鹿茸中20种无机元素含量，并结合正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，以期用于不同种类、等级该药材的鉴别，也可为其质量标准研究提供参考。

1 材料

ETHOS.SE微波消解仪(意大利Milestone公司)；ICAP RQ电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)(美国赛默飞公司)；101-2AB电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；ZYCGF-II-10T卓越超纯水机(四川卓越水处理设备有限公司)。

混合标准物质(BWT30101-N-100，批号B21070048，坛墨质检科技股份有限公司)，质量浓度分别为Na、Mg、K、Ca 400 μg/mL，Fe 100 μg/mL，Sr 20 μg/mL，Ti、Cu、Mn、Zn、Ba 10 μg/mL，Li、Tl、Pb、As、Co、V、Cr 1 μg/mL，Mo、Cd 0.1 μg/mL，使用前稀释至所需质量浓度。65%浓硝酸为分析纯(德国默克公司)。49批鹿茸由成都晶博生物科技有限公司(原四川省中药材公司都江堰养鹿场)提供，保存于成都中医药大学，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 供试品溶液制备 精密称取药材粉末(过2号筛)0.25 g，置于消解罐中，依次加入7.0 mL浓硝酸、1.0 mL超纯水，将消解罐放入微波消解仪中，条件见表2，消解完后取出，放到电热板上赶酸至1 mL，冷却后转移至50 mL量瓶中，超纯水混匀[16]，即得。

表2 微波消解条件

2.2 ICP-MS测定条件 等离子体功率1 550 W，体积流量14.0 L/min；辅助气体积流量0.8 L/min；雾化室温度2.7 ℃；蠕动泵转速40 r/min；采样深度5 mm；重复次数3次。

2.3 数据处理 通过SIMCA 14.1软件建立不同等级、品种鹿茸的OPLS-DA判别模型，采用Origin 2021 b软件绘图。

3 结果

3.1 无机元素含量测定 表3显示，Na、K、Mg、Ca等常量元素含量较高，约占总无机元素含量的90%以上；微量元素中Fe、Ti、Zn、Sr、Ba含量较高，Cr、Mn、Mo、Cu含量较低；Cd、Pb、V、As等重金属元素均未检出；不同种类、等级鹿茸中总无机元素含量均有差异，其高低与药材骨化程度密切相关，与文献[17-18]报道相符。

表3 各无机元素含量测定结果(mg/g)

3.2 模型建立

3.2.1 2020年版《中国药典》收载与未收载鹿茸的区分 梅花鹿茸与马鹿茸收载于2020年版《中国药典》，而驯鹿茸、花马鹿茸等均未被收载。OPLS-DA[19]测得累积解释能力参数R2X为0.922，R2Y为0.896，预测能力参数Q2为0.838，表明模型稳定可靠。图1显示，49批样品分为2类，S8～S15、S26～S30、S36～S49为1类，其他鹿茸为1类，两者区别显著；变量投影重要性(VIP)值大于1者为Ca、Mg、Ti、Zn、Mn、Cr，即对模型分组的贡献较大；置换验证R2为0.896，其截距为0.145，而Q2为0.837，其截距为-0.569，表明模型无过拟合现象，具有较好的预测能力。

3.2.2 梅花鹿茸与马鹿茸的区分 对样品S8～S15、S26～S30、S36～S49中无机元素含量进行OPLS-DA分析，测得R2X为0.825，R2Y为0.993，Q2为0.985，表明模型稳定可靠。图2显示，20批样品可分为2类，S8～S15为1类(梅花鹿茸)，S26～S30、S36～S49为1类(马鹿茸)；VIP值大于1的无机元素为K、Na、Cu、Zn、Ba，即对模型分组的贡献较大；置换验证R2为0.993，其截距为0.197，而Q2为0.985，其截距为-0.768，表明模型无过拟合现象，具有较好的预测能力。

3.2.3 同一种类不同等级鹿茸的区分 采用OPLS-DA测得R2X为0.632，R2Y为0.543，Q2为0.50，表明模型稳定可靠。图3显示，19批马鹿茸可分为3类，S26、S30、S36～S38为1类(腊片)，S42～S47为1类(血片、粉片)；S27～S29、S48～S49为1类(骨片、角片)，其中血片和粉片、骨片和角片的分布空间相近；VIP值大于1的无机元素为Na、Mg、Ba、Sr、Ti，即对模型分组的贡献较大；R2为0.947，其截距为0.117，而Q2为0.803，其截距为-5.19，表明模型无过拟合现象，具有较好的预测能力。

3.2.4 不同种类鹿茸的区分 采用OPLS-DA测得R2X为0.874，R2Y为0.661，Q2为0.61，表明模型稳定可靠。图4显示，49批样品可分为6类，S1～S7为1类(驯鹿茸)，S8～S15为1类(梅花鹿茸)，S21～S25为1类(狍鹿茸)，S26～S30、S36～S49为1类(马鹿茸)，S16～S20(花马鹿茸)、S31～S35(麋鹿茸)空间分布距离较近，各为1类；VIP值大于1的无机元素为Na、Cu、K、Mn、Cr、Ba、Sr；R2为0.990，其截距为0.023，而Q2为0.987，其截距为-0.332，表明模型无过拟合现象，具有较好的预测能力。

4 讨论与结论

课题组前期曾对49批鹿茸中无机元素含量进行主成分分析(PCA)，发现结果较差，6种鹿茸分布较散乱。再采用偏最小二乘回归分析(PLS-DA)，发现不同品种药材已出现较明显的分类趋势，但分布不够集中。OPLS-DA可去除无关联的噪音变量，具有更好的可解释性，故本实验采用该方法进行鉴别。

鹿茸种类较多，市场上常将驯鹿茸、花马杂交鹿茸等未被2020年版《中国药典》收载的品种充当梅花鹿茸等药典收载的品种来谋取暴利，本实验通过OPLS-DA实现了区分。梅花鹿茸、马鹿茸虽然均为药典收载品种，但前者市场价格远高于后者，故后者充当前者的现象较严重，故有必要通过OPLS-DA对两者进行区分。同种鹿茸之间由于等级不同(腊片、粉片与血片、角片与骨片)，价格差别较大，但粉片与骨片、角片与骨片之间没有明确限定，常混为一类，而OPLS-DA能对其进行较好的区分。除此之外，OPLS-DA还可用于不同种类鹿茸的区分。

综上所述，本实验通过ICP-MS结合OPLS-DA实现了对不同种类、等级鹿茸的鉴别，可为其他动物角类药材的质量控制提供参考依据。