温清饮HPLC指纹图谱建立及7种成分同时测定

2022-12-04司徒惠君唐铭蔚任孟月

中成药 2022年10期

司徒惠君，王谊，王宓，唐铭蔚，任孟月

(广东药科大学中药学院，广东广州 510006)

为了推动经典名方复方制剂的稳步发展，建立其质量控制评价方法是基础[1]。温清饮为《万病回春》中经典名方，是四物汤与黄连解毒汤的合方，由当归、川芎、白芍、熟地、黄连、黄柏、黄芩、栀子8味中药组成[2]，方中当归养血活血，白芍、熟地养血柔阴，川芎活血行气，四药表其“温”；黄连清热泻火，黄芩、黄柏清热养阴，栀子清火解毒，四药表其“清”，共奏温补气血、清热解毒之功效，用于治疗虚热血崩[3]，现代临床也常用于治疗痛经[4]、银屑病[5]、痤疮[6]、接触性皮炎[7]、慢性湿疹[8-9]、复发性口疮[10]、溃疡[11]等疾病，疗效显著。

目前，对温清饮药理活性、临床应用的研究较为丰富，但尚未涉及成分分析等质量控制方面。因此，本实验建立温清饮HPLC指纹图谱，并同时测定没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，有助于制定该方质量标准，也可为其临床应用及新药开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AS型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SK8200H型超声波清洗器(上海五久自动化设备有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(广州市星烁仪器有限公司)；溶剂过滤器(天津市科亿隆实验设备有限公司)；BSA224S型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试剂与药物没食子酸(批号B21433，纯度98%)、黄芩苷(批号B20570，纯度98%)对照品购于上海源叶生物科技有限公司；绿原酸(批号L00701908029，纯度99%)、栀子苷(批号Z00311802022，纯度99%)、阿魏酸(批号A00211812016，纯度98%)、药根碱(批号Y05211704013，纯度98%)、小檗碱(批号B21379，纯度99%)、汉黄芩苷(批号H01911808023，纯度99%)、黄芩素(批号H01811804026，纯度98%)、汉黄芩素(批号H02911809013，纯度99%)对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司。温清饮中各药材分别购于康美药业股份有限公司、广东汇群中药饮片股份有限公司、广西紫云轩中药科技有限公司、广州采芝林药业有限公司、广州至信中药饮片有限公司，具体信息见表1，经广东药科大学刘基柱教授鉴定为正品。乙腈、磷酸、甲醇均为色谱纯，购于北京迈瑞达科技有限公司；水为超纯水。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Polaris 3 C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%～20%B；10～30 min，20%B；30～35 min，20%～24%B；35～42 min，24%B；42～50 min，24%～36%B；50～55 min，36%～38%B；55～60 min，38%B；60～62 min，38%～72%B；62～70 min，72%～80%B)；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

2.2 全方及溶液制备

2.2.1 全方取黄连、黄柏、黄芩、栀子、当归、川芎、白芍、熟地黄饮片各3 g，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火微沸60 min，4层100目纱布过滤药液，挤渣，滤液定容至240 mL，即得，平行制备10批。

2.2.2 供试品溶液精密量取全方2 mL，甲醇定容至10 mL，超声处理15 min，在4 ℃下静置12 h，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 对照品溶液精密称取没食子酸、绿原酸、栀子苷、阿魏酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，50%甲醇定容至10 mL量瓶中，即得(质量浓度分别为0.525、0.525、1.040、1.070、0.980、1.066、1.134、0.577、1.142、0.504 mg/mL)。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液1份(S1)，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，以19号峰为参照(S)，测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.01%～0.90%、0.66%～1.58%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液(S1)，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以19号峰为参照(S)，测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.01%～1.07%、0.81%～2.98%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液1份(S1)，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以19号峰为参照(S)，测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.01%～0.60%、0.49%～1.99%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成及相似度评价取10批样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”软件，采用中位数法，将色谱图S1设置为参照，时间窗宽度设置为0.5，结果见图1，可知共有30个共有峰，以19号峰为参照(S)，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别为0.01%～0.51%、8.25%～47.69%。再进行相似度评价，结果见表2，可知均大于0.963，表示各批样品来源相似度高，质量稳定。

表2 10批样品相似度

2.3.5 色谱峰鉴定取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，与HPLC指纹图谱共有模式图进行比对，结果见图2。由此可知，1、6、7、14、17、19、20、27～29号色谱峰分别为没食子酸、绿原酸、栀子苷、阿魏酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素。

2.3.6 共有峰归属取同一批药材，按“2.2.1”“2.2.2”项下方法分别制备全方及缺黄芩、缺黄连、缺黄柏、缺栀子、缺熟地黄、缺川芎、缺白芍、缺当归的阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图3。由此可知，各药材对共有色谱图均有贡献，其中11～12、16、18～19、22～29号峰来自黄芩，2、13～15、17号峰来自黄连，21号峰为黄柏特征峰，7号峰为栀子特征峰，1号峰来自白芍，30号峰来自川芎，5号峰来自当归，3～4号峰来自熟地黄，6号峰为黄柏、栀子共有，8～10、20号峰为黄连、黄柏共有。

2.4 各成分含量测定

2.4.1 全方及溶液制备同“2.2.1”“2.2.2”项。

2.4.2 色谱条件同“2.1”项。

2.4.3 线性关系考察取对照品溶液适量，50%甲醇制成含没食子酸11.42 μg/mL、药根碱41.6 μg/mL、黄芩苷420 μg/mL、小檗碱107.2 μg/mL、汉黄芩苷92.32 μg/mL、黄芩素21 μg/mL、汉黄芩素10.08 μg/mL，逐级稀释后在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表 3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系

2.4.4 精密度试验取“2.4.3”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.35%、0.60%、0.88%、0.79%、0.68%、1.99%、1.82%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液(S1)，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.69%、0.90%、1.75%、2.07%、1.80%、1.48%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 稳定性试验按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液1份(S1)，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为1.88%、1.48%、1.76%、0.49%、1.86%、1.71%、1.83%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 加样回收率试验精密量取各成分含量已知的全方，按高、中、低质量浓度(0.8、1.0、1.2倍)分别加入一定量对照品，按2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素平均加样回收率分别为96.99%、97.94%、97.91%、98.13%、100.17%、98.40%、97.71%，RSD分别为1.72%、1.34%、1.24%、1.77%、1.05%、1.71%、1.85%。

2.4.8 样品含量测定按“2.2.1”项下方法制备10批供试品溶液，每批平行3份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相、检测波长选择本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、0.1%磷酸-乙腈、0.1%磷酸-甲醇、0.01 mol/mL磷酸二氢钾-乙腈，发现有机相为甲醇时系统压力明显升高，而且磷酸二氢钾盐会导致色谱峰稳定性下降，故选择0.1%磷酸-乙腈作为流动相，此时基线平稳，各成分分离度良好，峰形稳定。再考察了230、260、270、290、320 nm波长处色谱信息，发现在270 nm处各成分色谱峰分离度均较好。

3.2 含量分析黄芩苷、小檗碱含量最高，其中前者是黄芩主要黄酮类成分，可抗炎[12]、抗菌[13]、抗肿瘤[14-15]、调节免疫[16]，而后者是黄连、黄柏中含量最高的生物碱类成分，具有明显的降血糖[17]、抗肿瘤[18]、抗菌[19]等作用，此外汉黄芩苷含量也较高。虽然不同批次温清饮中药材来源较稳定，但主要成分含量仍存在一定差异，可能与原料产地、采收时间有关。