阿胶不同酶解物HPLC指纹图谱建立

付英杰， 王 肖， 贾玉民， 侯 林， 王建安， 于定荣， 赵颖异

(1.济宁医学院药学院，山东 日照 276826；2.东阿阿胶股份有限公司，国家胶类中药工程技术研究中心，山东 聊城 252201；3.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；4.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

阿胶是传统动物药，主含胶原蛋白[1]。由于加工时间长、步骤繁琐、辅料多，工艺指标难以量化，成分复杂，产品为随机结构的水解物。阿胶中所含成分是蛋白质、肽和氨基酸，还含有丰富的微量元素[2]，其中小肽段组分为阿胶等动物药的药效物质基础[3-4]。

目前国内外对胶剂质量控制方法各有优缺点。HPLC法精密度高，但耗时长、样品处理难度较大；HPLC-MS法灵敏度最高，但需要大型数据库的支持，分析费用昂贵[5-6]；普通凝胶电泳法简单快速，但由于胶剂的分子量是在一个范围，因而普遍存在精密度较低、条带模糊的现象[7-8]。其他方法各有其理论及假说支持[9-16]，但相关设备的普及性尚显不足。2015年版《中国药典》采用MS法对阿胶进行质量控制[1]。研究胶剂时发现中药胶剂水溶液的普通SDS-PAGE电泳谱有2～4条模糊条带，鉴定依据不足，然而其胰蛋白酶水解液的Tricine-SDS-PAGE电泳谱出现多条固定位置的细条带，且采用不同酶对动物胶进行水解，由于不同蛋白酶的酶切位点不同，条带位置具有一定差异。该法可对不同物种(阿胶、鹿角胶、龟甲胶)胶剂进行分辨，但无法分辨不同厂家相同物种胶剂，且方法较繁，精细度不足，仅作为胶剂定性鉴别思路之一[8]。

采用不同蛋白酶对中药胶剂进行酶解，取不同蛋白酶的酶解产物作为样品进行HPLC特征谱带研究，相当于把1个样品划分为多个样品，其显示的信息量是单一药材的多数倍，且由于酶切位点固定，样品会按照酶解规律进行裂解，成为固定的低分子量肽，如能进行分离，则可显示其指纹特征性。

1 材料

α-糜蛋白酶(批号B604BA0026，1 000 U/mg)、胰蛋白酶(批号C119BA0026，≥300 U/mg)木瓜蛋白酶(批号B709BA0015，≥3 500 U/mg)、胃蛋白酶(批号B326BA0296，3 000 U/mg)、胰糜蛋白酶(批号B329BA0126，2 400∶400 U/mg)均购于生物工程(上海)股份有限公司。阿胶(山东东阿阿胶股份有限公司，批号1305077、1407017、1505039)。其余试剂均为色谱纯。

PH-3E酸度计(南京桑力电子设备厂)；岛津LC-20A高效液相色谱仪[岛津国际贸易(上海)有限公司]；SYC-15c超级恒温水浴(南京桑力电子设备厂)。

2 方法

2.1 酶解液的制备 阿胶加纯水加热配成体积分数为5%的溶液，40 ℃水浴中酶解4 h，制成胃蛋白酶酶解液(将pH调至2.0，加胃蛋白酶10万U/g)、胰蛋白酶酶解液(将pH调至8.0，加胰蛋白酶5 000 U/g)、木瓜蛋白酶酶解液(将pH调至6.0，加木瓜蛋白酶10万U/g)，接着于95 ℃水浴中灭活20 min，冷却后依次使用脱脂棉、定量滤纸和0.45 μm微孔滤膜进行过滤，得阿胶酶解物样品。

2.2 色谱条件 Dikma C18色谱柱；流动相0.2 mol/L Na2SO4-H3PO4(pH 2.3)(A)-90%乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，90%～84%B；5～25 min，84%～72%B；25～35 min，72%～60%B；35～40 min，60%～48%B)；体积流量1 mL/min；进样量20 μL；检测波长280 nm。

2.3 酶种类的筛选 拟筛选蛋白酶种类有胃蛋白酶(切断氨基或羧基端为芳香族氨基酸或亮氨酸的肽键)、胰蛋白酶(选择性的水解蛋白质中由赖氨酸或者精氨酸的羧基所构成的肽链)、木瓜蛋白酶(切断L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键)、糜蛋白酶(切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧)、胰糜蛋白酶。糜蛋白酶酶解条件为pH 8.0，加酶量25 000 U/g；胰糜蛋白酶酶解条件为pH 8.0，加酶量25 000 U/g。

2.4 蛋白酶用量的考察 按“2.1”项下方法，分别制备胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。以峰形、分离度等为指标，筛选出蛋白酶的用量。

2.5 干扰因素考察 辅料干扰，由于阿胶在制作过程中加入了黄酒、豆油、冰糖，因此，需要考虑将这些干扰因素去除，因样品为水溶液，且经过脱脂棉过滤，已经去除了油脂，所以辅料干扰主要为黄酒和冰糖；试剂干扰，由于在酶解过程中加入了NaOH调节pH，所以可能会有试剂的干扰峰；蛋白酶的干扰[17]。

按“2.1”项下方法，分别制备黄酒、冰糖(5 g)、黄酒+冰糖、NaOH(pH 8.0)、纯水、NaHCO3(pH 8.0)的胰蛋白酶酶解液，以及NaOH (pH 8.0)水溶液、4种酶的水溶液。上述样品均配制5 mL，以确定干扰峰。

2.6 精密度试验 按“2.1”项下方法，分别制备阿胶的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，以S1为参照图谱，时间窗为0.2 min，进行全谱峰匹配，然后计算相似度，酶解液相似度分析结果应达到0.90以上，且主要色谱峰的保留时间及峰面积RSD<5%。

2.7 稳定性试验 按“2.1”项下方法，分别制备胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液，当日不进样的样品迅速冷冻，在第2、3、4、5天融化后分别进样。以第1天色谱图作为对照，考察同一批阿胶在制成样品后的稳定性。

2.8 重现性试验 按“2.1”项下方法，分别制备胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。以相似度为指标，考察使用不同C18色谱柱、不同人员进行HPLC获得色谱图的重现性。

2.9 验证性试验 随机称取3批次的阿胶各10 g，按“2.1”项下方法，分别制备胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解液，按“2.2”项下色谱条件进样测定。截取5～40 min色谱图，扣除掉干扰进行结果分析。

3 结果

3.1 酶种类的筛选 由图1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解液分离出较多峰，其次为胃蛋白酶，而胰糜蛋白酶有较多小峰，难以与噪音区分，这是因为双酶合用，酶解后形成的肽分子量小，且酶解产物更不稳定，因此弃用胰糜蛋白酶。

注：S1为胃蛋白酶酶解，S2为胰蛋白酶酶解，S3为木瓜蛋白酶酶解，S4为糜蛋白酶酶解，S5为胰糜蛋白酶酶解。

3.2 蛋白酶用量的考察 由图2可知，胃蛋白酶用量在1×105U/g以下时，峰形有变化，加大酶量，峰形基本不变。因此，胃蛋白酶加酶量选择为1×105U/g。同理，胰蛋白酶为25 000 U/g，木瓜蛋白酶为3×105U/g，糜蛋白酶为 25 000 U/g。

注：A为胃蛋白酶酶解，B为胰蛋白酶酶解，C为木瓜蛋白酶酶解，D为糜蛋白酶酶解。S1为原酶量(胃蛋白酶的原酶量为1×105 U/g，胰蛋白酶的原酶量为5 000 U/g，木瓜蛋白酶的原酶量为1×105 U/g，糜蛋白酶的原酶量为5 000 U/g)，S2为3倍原酶量，S3为5倍原酶量，S4为1/5倍原酶量，S5为7倍原酶量。

3.3 干扰因素排除 由图3～4和表1可知，辅料黄酒在9.0、13.6、14.9、17.1 min出峰，冰糖在8.9、11.8 min出峰，峰面积较大，按阿胶中含有0.5%辅料量进行计算，其峰面积均应在10 000以下，对阿胶酶解液的低肽或蛋白出峰干扰可忽略不计；而试剂水、NaOH、NaHCO3在整个过程中并没有出峰，说明辅料及试剂对阿胶特征峰没有干扰。胰蛋白酶除在19.8 min处有一小的干扰，其他峰面积均小于10 000，其干扰可以忽略不计；胃蛋白酶在12.0 min处有一干扰峰；糜蛋白酶在10.4、12.0、14.6 min处有3个干扰峰；木瓜蛋白酶效果较差，在7.1、9.1、12.3、12.8、14.2、15.0 min有6个干扰峰，因此在后续试验中，需要扣除掉这些干扰峰。

注：S1为黄酒的胰蛋白酶酶解液，S2为冰糖的胰蛋白酶酶解液，S3为黄酒+冰糖的胰蛋白酶酶解液，S4为NaOH的胰蛋白酶酶解液，S5为纯水的胰蛋白酶酶解液，S6为NaOH水溶液，S7为NaHCO3的胰蛋白酶酶解液。

注：S1为胃蛋白酶空白，S2为胰蛋白酶空白，S3为木瓜蛋白酶空白，S4为糜蛋白酶空白。

3.4 精密度试验 同一批样品连续测定，扣除酶干扰，选取时间窗0.2 min，匹配数目6。所有峰的保留时间RSD均<2%，峰面积RSD除木瓜蛋白酶8.25 min处外均在2%～10%。木瓜蛋白酶6次试验中5次相似度>0.9，胰蛋白酶和糜蛋白酶精密度及相似度均符合要求。胃蛋白酶的相似度不达标，在15～40 min处出现基线漂移，但5～12 min峰形重复较佳。

3.5 稳定性试验 在相同条件下于不同日期对阿胶样品进行检测，峰形逐渐发生变化，相似度逐渐下降，以相似度<0.9为依据，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解物分别在2、4、3 d之后不可用，因此，样品最好当日或第2天进样。

表1 各种干扰成分对比参数

3.6 重现性试验 分别采取不同型号的色谱柱和3名试验人员分别对4种酶解物进样5次，峰形不变，所有样品相似度均>0.9，表明方法重现性良好。

3.7 验证性试验 按匹配数目3、时间窗为0.2 min，并扣除酶干扰。胃蛋白酶特征峰为6.6 min，保留时间RSD为5.33%，峰面积RSD为22.6%，相似度均<0.9，不符合要求。胰蛋白酶特征峰在6.5、11.3、11.5、12.4 min处，保留时间RSD分别为1.19%、0.42%、0.42%、0.41%，峰面积RSD分别为24.96%、4.43%、14.82%、27.54%，相似度均>0.9。木瓜蛋白酶特征峰在10.9、11.3、11.8 min处，木瓜蛋白酶空白峰分布于9～15 min，干扰较大、峰形杂乱，保留时间RSD分别为0.2%、1.44%、1.91%，峰面积RSD分别为19.45%、27.3%、18.09%，相似度均>0.9。糜蛋白酶特征峰在13.0、13.4、13.8、15.1、18.2、33.6 min处，保留时间RSD分别为0.47%、0.51%、0.47%、0.45%、0.41%、0.19%，峰面积RSD分别为9.89%、9.24%、9.84%、14.64%、23.18%、5.36%，相似度均>0.9。见表2、图5。

表2 验证性试验相似度结果

4 讨论

中药植物药指纹图谱的特征峰RSD小于5%[18]。蛋白类色谱图通常分离度较差[19]。在重现性试验中，由于不同色谱柱的保留时间有差异，难以调整T值一致，但采用调整时间窗为0.2，以相似度为指标，来判定峰形的一致性。本研究中流动相的酸及盐浓度均较高，对于普通C18色谱柱具有一定磨损。

图5 验证性试验东阿阿胶HPLC色谱图

尽可能获得酶解程度一致的样品，这就需要使用蛋白酶充分水解阿胶药材以获得成分较为稳定的小肽。基于此，选用蛋白酶酶解的最长时间4 h，以及最适pH值以获得蛋白酶的最大活力。

针对阿胶质量控制上样品信息不全面以及指纹图谱空缺，通过多种蛋白酶酶解物，无需质谱，仅需使用原有液相仪器即可。由于使用多酶解物样品进样，且方法为指纹图谱而非单一成分，掺假难度极大，对打击混伪品有较大的应用价值。采用不同蛋白酶的酶解产物作为样品进行特征谱带研究，其信息量更大，且由于酶切位点固定，各样品的酶解物组成相对稳定。

本研究为后续进行的酶解物-HPLC法对阿胶的特征峰及规律研究提供方法学基础，并为中药胶剂的质量评价提供一种新思路。