冬凌草甲素通过下调lncRNA AFAP1-AS1表达对人乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用

李志明， 黄 勇， 龙 凤,2*， 孙少康， 刘晓燕， 赵 玉

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000)

乳腺癌是女性最常见的癌症之一，已成为世界第一大癌症[1]。三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种亚型，由于其特殊的分子异质性及高侵袭性，目前药物、手术效果均欠佳[2-5]，故明确本病内在分子机制，研发高效、低毒、可靶向性的抗癌新药及药物组合刻不容缓。冬凌草甲素是冬凌草的主要活性成分，多次被报道在乳腺癌中扮演抗癌角色，但其具体抗癌分子机制尚不明确。已有研究表明AFAP1-AS1在乳腺癌中高表达，患者具有较高的转移和复发风险[6]，敲低AFAP1-AS1可通过影响上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关基因的表达来抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[7]。lncRNA可充当microRNA(miRNA)海绵或竞争性内源RNA(ceRNA)，调控下游靶基因，影响癌细胞恶性生物学行为。因此，本研究观察siRNA靶向沉默lncRNAAFAP1-AS1并联合冬凌草甲素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的影响，分析冬凌草甲素抗三阴性乳腺癌可能的ceRNA调控分子机制，旨在进一步揭示冬凌草甲素抗乳腺癌作用的新分子靶标，以期为以lncRNAAFAP1-AS1为靶点研发治疗乳腺癌的靶向药物及药物组合提供药理学依据和奠定科学理论基础。

1 材料

1.1 细胞株 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中国科学院上海细胞库，编号TCHu227。

1.2 试剂与药物 冬凌草甲素(批号3239848，纯度94.2%)购自美国Merck公司。CCK-8试剂盒(批号LK811)购自日本同仁公司；Transwell小室(批号02920022)、Matrigel基底胶(批号9343008)购自美国Corning公司；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒(批号S1230)、人属AFAP1-AS1引物(批号T0814)、riboFECT CP Transfection Kit(批号T0915)、RiboTM h-AFAP1-AS1 Smart Silencer-2(批号T0824)、lncRNA Smart Silencer NC#1(批号T0710)购自广州锐博生物技术有限公司；兔抗人GAPDH(批号YM3215)、Vimentin(批号YT4879)、E-cadherin(批号YT1454)、N-cadherin多克隆抗体(批号YT2988)，HRP标记山羊抗兔IgG二抗(批号RS002)均购自苏州睿瀛生物技术有限公司；兔单克隆抗体CDC42(批号ab187643)购自英国Abcam公司；小鼠单克隆抗体MAP3K10(批号sc-393675)购自美国Santa Cruz公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(批号CR2012171)购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器 HERAcell VIOS 160i型CO2恒温培养箱、Varioskan LUX型酶标仪(美国Thermo公司)；LightCycler®96型实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)；PowerPacTM Basic型电泳槽/电转移装置(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 人乳腺癌MDA-MB-231细胞加到含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期者进行实验。

2.2 细胞转染及分组 采用riboFECTTM CP试剂盒、RiboTM lncRNA Smart Silencer试剂沉默MDA-MB-231细胞中AFAP1-AS1表达，由广州锐博生物技术有限公司合成AFAP1-AS1 siRNA的靶序列和包括在人转录组中没有靶标的siRNA作为非靶标对照(si-NC)。用riboFECTTM CP转染试剂在6孔板中以30%～50%的细胞密度进行siRNA转染，并孵育48 h。取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以4 μg/mL冬凌草甲素处理的细胞作为冬凌草甲素组；将si-NC、si-AFAP1-AS1分别转染至MDA-MB-231细胞中，作为siNC、siAFAP1-AS1组；将si-NC、si-AFAP1-AS1分别转染至MDA-MB-231细胞中，再用4 μg/mL冬凌草甲素处理，分别作为siNC+冬凌草甲素、siAFAP1-AS1+冬凌草甲素组；对照组加入含或者不含有血清、0.1% DMSO的DMEM培养液。

2.3 CCK-8法检测细胞活力 以每孔3×103个细胞的密度接种到96孔培养板中，培养过夜后将细胞培养液更换为含有不同质量浓度冬凌草甲素(0、2、4、6、8 μg/mL，DMSO溶解)的新鲜培养基，分别培养24、48、72 h；或将细胞按“2.2”项下方法分组及给药，培养48 h，加入CCK-8溶液，培养箱中继续培养2 h，采用酶标仪在450 nm波长处检测光密度(OD)值。对照孔细胞存活率为100%，计算各组细胞相对存活率。

2.4 RT-qPCR法检测AFAP1-AS1 mRNA表达 收集各组细胞，采用RNAiso Plus试剂提取总RNA，超微量核酸蛋白测量仪在260 nm/280 nm波长处检测RNA浓度。根据riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒说明书检测各组细胞AFAP1-AS1 mRNA表达，反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，延伸30 s，共40个循环。AFAP1-AS1正向引物序列5′-CGGCATCCAACTCACAAGAC-3′，反向引物序列5′-GTCCTCTTCCCATGTGAGTCATC-3′，GAPDH内参引物由广州锐博生物技术有限公司提供。采用2-ΔΔCT法分析AFAP1-AS1相对表达。

2.5 划痕实验 将各组细胞以每孔1×106个的密度接种于含完全培养基的6孔板中，待细胞生长至80%～90%后更换为不含血清的培养基培养12 h，200 μL枪头在每孔中划线，PBS洗去脱落的细胞，加入无血清的含药或不含药培养液，培养48 h，在倒置显微镜下观察0、48 h划痕愈合的情况，并计算迁移率。实验重复3次。

2.6 Transwell侵袭实验 将40 μL用DMEM稀释后的基质胶均匀铺在Transwell小室底部，在37 ℃下孵化过夜，将各组MDA-MB-231细胞密度调整为5×105/mL。Transwell上室加入100 μL细胞悬液，下室每孔加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，用棉签拭子擦除小室上层未侵袭的细胞，4%福尔马林固定膜下的细胞，0.1%结晶紫染色，在倒置显微镜下拍照计数。

2.7 Western blot法检测CDC42、MAP3K10蛋白及EMT相关蛋白表达 取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，按“2.2”项下方法分组及给药，培养48 h后收集细胞，采用高效RIPA裂解液裂解并提取蛋白，BCA法检测蛋白浓度并定量。蛋白样品加入4×蛋白上样缓冲液，水浴加热变性，保存备用。将各组蛋白加至PAGE胶中进行电泳，再移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭40 min，加入一抗GAPDH(1∶5 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 500)、CDC42(1∶10 000)、MAP3K10(1∶500)，在4 ℃下孵育过夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)或HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化学发光试剂盒和Western印迹成像系统检测目标条带灰度，以GAPDH为内参蛋白，计算目的蛋白相对表达。

3 结果

注：与正常组织比较，**P<0.01；与AFAP1-AS1低表达组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.1 lncRNAAFAP1-AS1在三阴性乳腺癌组织中高表达并与乳腺癌患者不良预后有关 分别通过GEPIA2和lnCAR database在线工具分析AFAP1-AS1在三阴性乳腺癌组织中的表达，结果如图1A～1B所示，可知AFAP1-AS1在正常乳腺组织和三阴性乳腺癌组织中差异性表达(P<0.01)；与正常乳腺组织比较，AFAP1-AS1在三阴性乳腺癌组织中高表达(P<0.01)。为了进一步探讨AFAP1-AS1在乳腺癌患者中的预后意义，通过lnCAR database在线工具“survival analysis模块”分析AFAP1-AS1表达与乳腺癌患者总生存期和无复发生存期的相关性，结果如图1C～1D所示，与AFAP1-AS1低表达的乳腺癌患者比较，AFAP1-AS1高表达的乳腺癌患者的生存期降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 冬凌草甲素调控lncRNAAFAP1-AS1表达对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如表1所示，与对照组比较，冬凌草甲素组细胞存活率降低，并呈现时间和剂量依赖性(P<0.05，P<0.01)。如表2所示，与对照组比较，冬凌草甲素下调了MDA-MB-231细胞中AFAP1-AS1 mRNA表达(P<0.05)。

如表3所示，与si-NC组比较，沉默AFAP1-AS1表达后，细胞存活率降低(P<0.01)，siAFAP1-AS1和冬凌草甲素联合使用对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用比单独应用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更为明显(P<0.01)。

表1 冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞存活率的影响

表2 冬凌草甲素或siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞AFAP1-AS1 mRNA表达的影响

表3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞存活率的影响

3.3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响 如图2、表4所示，与si-NC组比较，siAFAP1-AS1组细胞相对迁移率、侵袭细胞数均降低(P<0.05)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素联合使用对细胞迁移、侵袭的抑制作用比单独应用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更显著(P<0.01)。

图2 各组MDA-MB-231细胞迁移(A)和侵袭(B)能力(×200)

表4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响

3.4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞中EMT相关蛋白表达的影响 如图3、表5所示，与对照组比较，冬凌草甲素组和siAFAP1-AS1组细胞E-cadherin蛋白表达均升高(P<0.05，P<0.01)，N-cadherin和Vimentin蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素联合使用上调E-cadherin蛋白表达，下调N-cadherin和Vimentin蛋白表达的作用比单独应用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更显著(P<0.01)。

图3 各组MDA-MB-231细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达

3.5 基于生物信息学分析lncRNAAFAP1-AS1的靶基因 在线数据库ENCORI、DIANA-LncBasev.2预测与AFAP1-AS1相互作用的microRNA，取交集筛选出2个候选miRNA(图4A)为miR-2278、miR-155-5p。有研究报道，miR-155-5p是三阴性乳腺癌中差异上调的miRNA且miR-155-5p和AFAP1-AS1之间存在互补位点[8-9]。通过在线数据库ENCORI、miRDB和TargetScan7.2预测miR-155-5p的靶基因，共找到包括丝裂原活化蛋白激酶激酶10(MAP3K10)在内的220个靶基因(图4B)。通过Bioconductor在线软件对220个靶基因进行GO(图4C)和KEGG信号通路(图4D)分析，发现其共同靶点主要富集于DNA结合转录激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、泛素样蛋白连接酶结合、钙黏蛋白结合和细胞粘附分子结合等关键生物过程；主要富集于多种癌症通路，MAPK、PI3K-Akt和催乳素信号通路。

表5 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白表达的影响

图4 生物信息学分析

3.6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞中CDC42、MAP3K10蛋白表达的影响 如图5、表6所示，与对照组比较，冬凌草甲素和siAFAP1-AS1均可下调CdC42、MAP3K10蛋白表达(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素联合使用对细胞CdC42、MAP3K10蛋白表达的抑制作用比单独应用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更显著(P<0.01)。

图5 各组MDA-MB-231细胞中Cdc42、MAP3K10蛋白表达

4 讨论

目前已证实lncRNA作为新功能调控分子，参与多种恶性肿瘤发生、发展过程[10-11]。一项荟萃分析显示，AFAP1-AS1在多种癌症中均上调，AFAP1-AS1高表达与不良的临床结果(如淋巴结转移和远处转移)密切相关并参与肿瘤进展[12]。

表6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1对MDA-MB-231细胞Cdc42、MAP3K10蛋白表达的影响

本研究通过在线数据库分析，进一步证明了AFAP1-AS1过表达与乳腺癌患者总生存期和无复发生存期呈负相关。冬凌草甲素被报道可下调人胰腺癌BxPC-3和PANC-1细胞中AFAP1-AS1的表达[13]。本研究发现，与对照组比较，冬凌草甲素可下调细胞中AFAP1-AS1表达，与报道一致，结果表明AFAP1-AS1可能是冬凌草甲素治疗乳腺癌的潜在分子靶标。

本研究探讨了冬凌草甲素联合siAFAP1-AS1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响，结果表明，冬凌草甲素组和siAFAP1-AS1组细胞活力、迁移率和侵袭率均降低，且联合使用对细胞抑制作用更显著。EMT是肿瘤迁移的早期事件，它与细胞间连接的结构变化有关，对癌细胞迁移至关重要，本研究结果表明，与单独应用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1比较，冬凌草甲素联合siAFAP1-AS1可降低EMT相关标记蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白表达，升高E-cadherin蛋白表达，提示冬凌草甲素联合siAFAP1-AS1治疗乳腺癌可获得更佳的抗癌疗效。

研究表明lncRNA参与ceRNA-miRNA-mRNA调控网络，它维持调控癌细胞中基因通路的活性和功能平衡[14-15]。本研究通过在线数据库分析共找到包括MAP3K10在内的220个靶基因，而MAPK为显著性富集的信号通路之一。MAP3K10是MAPK信号通路关键调控分子，可通过激活MKK4和MKK7激活JNK通路，参与细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程[16-17]。研究发现，MAP3K10在胰腺导管腺癌组织和细胞系中表达上调，MAP3K10过表达促进胰腺癌细胞增殖[18]。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是MAP3K10上游的信号分子，参与调节肿瘤细胞迁移和侵袭、上皮间质转化、细胞周期进程和肿瘤血管生成等[19]。在乳腺癌中，Cdc42能够与下游效应蛋白相互作用，抑制表皮生长因子受体降解，从而使MAPK被持续激活，最终造成肿瘤细胞的增殖、转移[20]。因此，推测Cdc42/MAP3K10可能作为AFAP1-AS1靶点参与冬凌草甲素和siAFAP1-AS1抑制MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的作用。本研究发现，单独应用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1均可下调MDA-MB-231细胞中CDC42、MAP3K10蛋白表达；联合使用对细胞中CDC42、MAP3K10蛋白表达的抑制作用更显著，提示冬凌草甲素和 siAFAP1-AS1对Cdc42/MAP3K10信号通路存在一定的抑制作用。

综上所述，冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用可能是通过下调AFAP1-AS1表达进而抑制Cdc42/MAP3K10信号通路实现的。此实验结果为冬凌草甲素应用于乳腺癌的治疗提供了新的药理学依据，为以lncRNAAFAP1-AS1为靶点研发治疗乳腺癌的靶向药物及药物组合提供了可能。