基于网络药理学探究十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病的分子机制

梁沛余， 常秀君， 马晓雨， 韩惠竹， 夏晓晓， 吴 穹*

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430000)

十八味诃子利尿丸源自《藏医医诀补遗》，是由诃子、红花、豆蔻、余甘子等药材炮制而成的经典藏药复方，是藏医临床治疗糖尿病及相关病症的经典方剂[1]。课题组前期实验研究发现，十八味诃子利尿丸具有良好的降糖效果，可改善糖尿病大鼠“三多一少”症状，其机制与改善氧化应激状态关系密切[2]。糖尿病脑病是糖尿病的重要并发症，以认知功能障碍为主要临床表现，以神经元损伤、炎性环境形成为重要病理特点。诃子、红花、余甘子、蒺藜等已被证实对脑损伤具有一定的保护作用，同时课题组前期研究也已发现十八味诃子利尿丸对于脑缺血/再灌注损伤模型具有保护作用[3]，提示，十八味诃子利尿丸对糖尿病脑病可能具有一定的干预效能，但目前尚未见相关研究报道。

网络药理学是全面系统揭示药物作用机理的新学科，为探讨藏药复方多靶点、多维度作用机理拓展了新的思路。本研究拟应用网络药理学方法探究十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病的干预机理，并经过动物实验对预测结果进行初步验证，为指导藏医临床用药提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 十八味诃子利尿丸所含化学成分的筛选 利用TCMSP、TCMID、CNKI数据库检索十八味诃子利尿丸(诃子、红花、豆蔻、余甘子、姜黄、小檗皮、蒺藜、金礞石、刺柏、熊胆、牛黄、刀豆、山矾叶、渣驯膏、塞北紫堇、藏茜草、紫草茸、小伞虎耳草)的化学成分，并以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、血脑屏障通透性(BBB)≥-0.3、半衰期(HL)≥4为标准筛选有效化合物。

1.2 有效化合物对应靶点的筛选 利用PubChem数据库下载有效化合物结构，SwissTargetPrediction数据库预测相关靶标，同时在TCMSP数据库搜集化合物靶标，将2个数据库结果合并获得有效化合物的潜在靶点，若2个数据库均无收录信息则使用CNKI数据库进行文献检索。

1.3 疾病靶点筛选 利用GeneCards数据库搜索糖尿病脑病相关靶标，并以Relevance score ≥10、Gifts ≥40为标准筛选糖尿病脑病候选作用靶点。

1.4 药物-疾病作用靶点筛选与GO、KEGG富集分析 利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics在线绘制Venn图，获得复方潜在靶点与疾病相关靶点的交集，将交集基因上传DAVID数据库，获取药物靶点生物学过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞成分(cellular components,CC)等信息，随后进行KEGG通路分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 蛋白质互作网络(PPI)分析和Hub基因筛选 将药物靶点蛋白上传STRING 11.0数据库，获取蛋白质相互作用信息，利用Cytoscape软件将PPI网络可视化处理，MCODE插件筛选核心子网，CytoHubba插件筛选Hub基因，绘制草药-成分-核心靶点-通路作用网络。

1.6 动物实验验证 4周龄，体质量80～100 g的SD大鼠，随机分为空白组、模型组、十八味诃子利尿丸组，适应性饲养1周后，造模组通过高脂饮食14周+尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)20 mg/kg进行造模，7 d后血糖值>16.7 mmol/L视为糖尿病造模成功。十八味诃子利尿丸组每天灌胃给予十八味诃子利尿丸300 mg/kg，模型组则灌胃给予等量生理盐水，连续给药6周。断头取脑，4%多聚甲醛固定，逐级脱水后，包埋制片。苏木精-伊红染色法观测神经元损伤情况，免疫组织化学染色法观测小胶质细胞激活经典标志物钙离子结合适配分子1(IBA1)表达及筛选的核心靶点表达情况。

2 结果

2.1 十八味诃子利尿丸有效成分库和对应靶点库的构建 复方有效成分库共含有效化合物成分31个，其中诃子4个，红花9个，蒺藜7个，余甘子1个，姜黄3个，刀豆2个，牛黄1个，豆蔻7个，渣驯膏1个，小檗皮2个(图1A)；十八味诃子利尿丸靶点库共含作用靶点582个，其中诃子202个，红花338个，蒺藜53个，余甘子77个，姜黄72个，刀豆72个，牛黄4个，豆蔻316个，渣驯膏37个，小檗皮96个。

2.2 糖尿病脑病疾病靶点库的构建 利用GeneCards数据库检索糖尿病脑病全部靶点，共获得2 556个靶点信息，以Relevance score≥10、Gifts≥40为筛选标准，共获得候选靶点537个(图1B)。

图1 药物靶点筛选

2.3 药物作用靶点筛选和有效成分-靶点网络建立 将复方对应靶点库与糖尿病脑病疾病靶点库利用Venn图进行比对，发现107个共有靶点(图1C)，说明这107个基因在复方干预糖尿病脑病中发挥了重要作用。利用Cytoscape软件构建有效成分-靶点网络，共发现24个有效成分可与107个靶点形成映射关系(图2)，映射靶点数量前5名化合物为红花-baicalein(31个靶点)、红花-lignan(26个靶点)、豆蔻-dehydrodiisoeugenol(24个靶点)、豆蔻-jaranol(23个靶点)、诃子-cheilanthifoline(22个靶点)，这5种化合物靶点映射数目占总映射的39.5%。

图2 十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病成分-靶点图

2.4 药物作用靶点GO功能和KEGG通路分析 107个基因靶点GO功能分析发现生物学过程主要富集在血管生成的正向调控、脂多糖调控的信号通路、多肽丝氨酸磷酸化的正向调控、活性氧代谢的正向调控、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)级联信号的正向调控等过程(图3A)；细胞成分主要富集在胞质、轴突、内质网等位置(图3B)；分子功能主要富集在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活力、腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate, ATP)结合、血红素结合等功能(图3C)。KEGG通路分析发现这些基因主要在缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)信号、催乳激素信号、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)信号等多通路富集(图3D)，结果表明复方藏药十八味诃子利尿丸发挥作用是多靶点、多通路、多维度的系统综合效果。

图3 十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病靶点GO和KEGG分析

图4 十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病靶点PPI网络分析

2.5 药物作用靶点PPI网络分析 利用STRING数据库构建药物作用靶点PPI网络，并利用Cytoscape软件进行网络可视化处理，发现107个基因均参与构成网络，网络含1 567条边(图4A)，说明复方作用靶点间存在复杂的网络调控关系。紧接着通过MCODE插件筛选核心子网模块，发现67个基因组成5个核心子网，其中41个基因可构成1个含678条边构成的大子网模块(Score 33.9)(图4B)，其余26个基因构成Score≤6的4个小子网模块(图4C)。利用DAVID数据库对41个基因构成的大子网进行KEGG通路分析，结果显示核心大子网基因主要富集于HIF信号、TNF信号、Toll样受体信号等相关通路(图4D)。

2.6 药物作用靶点Hub基因筛选 基于构建的107个基因靶点PPI网络，利用Cytoscape软件的CytoHubba插件多算法筛选前20位的候选Hub基因，结果如表1所示，利用白组比较，模型组动物脑内高表达PTGS2；与模型组比较，给予十八味诃子利尿丸干预可降低PTGS2的表达(图6B)，证实十八味诃子利尿丸确实可通过多成分靶向PTGS2进而调控糖尿病脑病进程，与网络药理学预测结果相符。

表1 CytoHubba插件筛选候选Hub基因(前20位)

Venn图对筛选结果进行交集(图5A)，发现TLR4、MMP9、PTGS2、MAPK3、MAPK14、ALB是在多种算法中均排于前20位的Hub基因，PPI网络显示基因间存在互作关系(图5B)，也参与构建41个基因核心大子网模块。对6个基因在HIF信号、TNF信号、Toll样受体信号、催乳素信号、雌激素信号、VEGF信号等通路的富集情况进行探究，发现TLR4、MMP9、PTGS2、MAPK3、MAPK14 5个Hub基因富集于相关信号中，构成如图5C所示的药材-成分-靶点-通路调控网络，5个Hub基因的相关有效成分的药物代谢动力学参数如表2所示。

2.7 实验验证 Hub基因与有效成分的映射分析显示前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)是多种有效成分的共同作用靶点，可与20种关键有效成分中的18种存在映射关系，具有最高的成分-靶点映射数量(图6A)，同时由于其可广泛参与炎症、应激等过程，故选取PTGS2作为靶点蛋白进行验证。实验研究结果显示，与空白组比较，模型组动物精神萎靡，脑内出现明显的神经元损伤，神经元核固缩坏死，伴小胶质细胞过度激活；与模型组比较，给予十八味诃子利尿丸干预可改善动物精神状态，减轻糖尿病所致神经元损伤，并降低小胶质细胞炎性活化(图6B)。免疫组化研究显示，与空白组比较， 模型组动物脑内高表达PTGS2;与模型组比较，给予十八味诃子利尿丸干预可降低PTGS2的表达(图6B)，证实十八味诃子利尿丸确实可通过多成分靶向PTGS2进而调控糖尿病脑病进程， 与网络药理学预测结果相符。

图5 十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病 Hub基因靶点筛选

表2 有效成分的药理学和分子特性

图6 十八味诃子利尿丸干预糖尿病脑病大鼠的病理变化

3 讨论

糖尿病脑病是糖尿病发生过程中常见的并发症，常以认知功能障碍、语言表达能力下降等为主要临床表现，糖尿病人群患有老年痴呆的发生率明显高于其他人群[4]。藏医药有着完善的理论体系和丰富的临床实践经验[5-6]。十八味诃子利尿丸是藏医临床上常用的糖尿病治疗方剂，有临床研究显示，相比于常规用药的糖尿病患者，十八味诃子利尿丸干预有着更高的临床有效率和更低的不良反应率[7]。本研究通过网络药理学系统探讨了十八味诃子利尿丸治疗糖尿病脑病的作用机制，并通过动物实验对关键靶点进行初步验证。

糖尿病脑病发生与神经免疫炎症关系密切，临床研究显示，糖尿病脑病患者血清炎性因子水平高于正常人及无认知功能障碍的糖尿病患者，炎性因子水平与认知功能呈负相关，且机体炎症出现早于认知功能障碍[8]。小胶质细胞是中枢神经系统中的固有免疫细胞，具有释放炎性因子、神经营养因子、维持内环境稳态等功能[9]。Hwang等[10]发现相比于12周龄糖尿病早期阶段，30周龄慢性糖尿病阶段大鼠脑内小胶质细胞的特异性激活标志物IBA1的表达升高，其周围白介素1β的表达也上升，提示炎性激活的小胶质细胞会促进糖尿病大鼠海马神经元的损伤及衰老进程。体外研究则证实，高糖刺激下小胶质细胞可被激活，并上调TNF、iNOS等炎性基因的转录，上调Toll样受体4的表达，并且高糖对小胶质的激活作用与Toll受体经典激动剂脂多糖相当[11]。本研究显示，十八味诃子利尿丸可通过多成分映射到糖尿病脑病的107个作用靶点上，其中TNF信号、Toll样受体信号这2条经典炎性通路可能是其发挥抗糖尿病脑病的重要通路。验证实验显示，十八味诃子利尿丸可降低大鼠小胶质细胞的炎性激活。十八味诃子利尿丸有效成分中，berberine可改善糖尿病大鼠的学习记忆障碍，减轻神经元轴突病变，其机制与调控NF-κB的核转位进而调控炎症介质的释放关系密切[12]；ellipticine[13]、sitosterol[14]也被报道其在体外可抑制脂多糖激活下的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成。因此，十八味诃子利尿丸多成分、多靶点的抗炎效应可能是其治疗糖尿病脑病的核心机制之一。

本研究还发现，PTGS2是十八味诃子利尿丸多成分的共同靶标，其参与炎性信号调控，在组织损伤、炎症等情况下表达增强[15]，已被证实广泛参与多种急慢性神经损伤，其在老年糖尿病患者脑内高表达[16]。PTGS2可通过促进其下游前列腺素PGD2与其受体DPs的结合进而调控神经元自噬影响糖尿病发病进程中高糖环境对神经元的损伤作用[17]。糖尿病造模6个月后，小鼠可出现神经传导减慢，氧化应激，炎症反应等表现，COX-2-/-的糖尿病小鼠则无明显神经功能缺失[18]。这些结果说明，PTGS2在糖尿病所致脑损伤中发挥了重要作用，本研究也证实十八味诃子利尿丸可靶向PTGS2表达减轻糖尿病所致大鼠神经元损伤。

综上所述，十八味诃子利尿丸可通过多成分、多靶点、多维度发挥对糖尿病脑病的保护作用，本研究为进一步拓展经典藏药复方的临床应用提供了新思路。