瑞格列奈滴丸制备及体内外评价

王苗苗章一吴桐李海鹰杨文智

(1.保定市第一中心医院 药剂科,河北 保定 071000；2.河北大学 药学院,河北 保定 071002)

滴丸采用固体分散技术,将药物与基质熔融后,滴入与之无相互作用和不相混溶的冷凝液中,收缩冷凝而成的球状固体制剂[1],具有服用剂量少、崩解快、溶出迅速的特点,可用于制备小剂量难溶药物的剂型[2].滴丸基质对药物起到润湿、增溶、防止聚集和抑制结晶的作用,药物以分子、微晶或胶体状态存在于基质中使药物分散的总表面积增大,改善难溶性药物的溶解度、溶出度和吸收速率,从而提高药物的生物利用度[3].例如,以聚乙二醇6000(PEG-6000)为基质,制备番茄红素滴丸,可提高番茄红素的生物利用度[4]；利用固体分散技术制备复方丹参滴丸,可降低冰片的用量,提高药物生物利用度并减轻冰片对患者的胃肠刺激[5].水飞蓟素滴丸剂,不仅改善水飞蓟素溶解度,还促使多种中药成分同步释放[6].此外,文献采用固体分散技术,制备对乙酰氨基酚-聚乙二醇6000基质栓剂,同样使得难溶药物获得良好的体内生物利用度[7].近年,随着固体分散技术、滴丸制备工艺与新辅料的发展,滴丸剂开发日益受到研究者的重视[8].本研究采用自制瑞格列奈-精氨酸(RPG-Arg)复合物冻干粉,制备了RPG-Arg复合物滴丸并对照瑞格列奈原药滴丸,通过滴丸的物理表征、药物体外溶出和大鼠体内药代动力学评价,探讨瑞格列奈滴丸剂型制备的可行性.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LGJ-18冷冻干燥机(北京松源华兴发展有限公司)；FTIR-8400s傅里叶变换红外分光光度计(日本岛津仪器公司)；T6 型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；X 线粉末衍射仪(D8ADVACE)(Bruker/Switzerland)；LC3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司).

瑞格列奈(湖北康宝泰精细化工有限公司)；精氨酸(国药集团化学试剂有限公司)；PEG-4000和PEG-6000(天津市科密欧化学试剂有限公司)；RPG-Arg复合物粉末(实验室自制)；液体石蜡(天津市科密欧化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯.

Wistar大鼠(150～200 g),由河北省实验动物中心提供.

1.2 实验方法

1.2.1 RPG-Arg复合物冻干粉的制备

按物质的量比为2∶3分别称取瑞格列奈与精氨酸,混合于20 m L蒸馏水中,将溶液的p H 调至8,40℃水浴加热搅拌30 min,直至混合物完全溶解.将复合物溶液置于4℃过夜保存,在(-58±1)℃和5 Pa的压力下冷冻干燥24 h,得到RPG-Arg 复合物冻干粉.

1.2.2 滴丸基质的筛选

初步拟定瑞格列奈滴丸的规格为1 mg/丸,每丸质量30 mg,确定药物与基质质量比为1∶29.选用水溶性基质PEG-4000、PEG-6000和二者的混合物[m(PEG-4000)∶m(PEG-6000)为4∶1、4∶2、4∶3、1∶1、4∶5、4∶6]制备滴丸.参照《中华人民共和国药典》(2015版)中滴丸项下规定方法,以滴丸的溶散时间、丸质量差异、某一时间点的累计释放度为评价指标,优选制备处方.

1.2.3 滴丸的制备

按处方称取PEG-4000和PEG-6000适量,熔融混均后分别加入瑞格列奈和RPG-Arg复合物粉末,搅拌混匀,保持药液温度为80℃,控制滴距4 cm,滴入冷却高度为40 cm,4℃的石蜡冷凝液中,静置30 min取出滴丸,滤纸滤干,即得.

1.2.4 滴丸表征

DSC分析:分别称取瑞格列奈原料药、精氨酸、处方比例物理混合物、滴丸空白基质、粉碎后的自制瑞格列奈滴丸以及RPG-Arg复合物滴丸适量,称取3～5 mg样品置于铝锅中,在50 m L/min的氮气流保护,40～300℃的温度扫描条件下,以10℃/min的速率加热样品,得到各样品的DSC图谱.

FTIR 分析:测定瑞格列奈、精氨酸、滴丸空白基质(PEG-4000,PEG-6000)、滴丸制备比例的物理混合物、瑞格列奈原药滴丸、RPG-Arg复合物滴丸的红外光谱,分别称取各样品2 mg至研钵中,与溴化钾混合均匀,研磨,压片,在400～4 000 cm-1处检测并记录图谱.

1.2.5 体外溶出度实验

采用《中华人民共和国药典》(2015版)溶出度测定法中第三法(小杯法)进行滴丸的体外溶出实验.选择200 m L的磷酸盐缓冲液为溶出介质,调节转速至100 r/min,精密称取原料药滴丸和RPG-Arg复合物滴丸适量于杯中,分别在5、10、15和30 min后取样10 mL,同时补充同等条件的空白缓冲液10 m L,0.45μm 微孔滤膜过滤,采用UV测定2种滴丸中药物的质量浓度,检测波长282 nm,基质不干扰药物测定,瑞格列奈标准曲线为y=0.009 5x-0.001 7(R=0.999),线性为0.1～10μg/mL,按照公式(1)计算药物的累积释放率(Q).

ρn为第n次取样时样品中的药物质量浓度,μg/m L；V为释放介质总体积,m L；Vi为每次取样的缓冲介质体积,m L；ρi为 每次取样时的药物质量浓度,μg/m L；W0为滴丸中药物的质量浓度,μg/m L.

1.2.6 鼠体内药代动力学评价

用肝素处理过的EP管收集大鼠眼眶血,12 000 r/min离心10 min,取血浆,备用.移取大鼠空白血浆180μL分别置于8个EP管中,分别加入500、250、100、50、10、1、0.1μg/m L的瑞格列奈药物溶液20μL,不加药物的为空白血样.涡旋震荡2 min,使药物与血浆充分混合.加入有机相0.5 m L[V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=4∶1]涡旋震荡5 min,使之充分萃取瑞格列奈药物,将样品12 000 r/min离心10 min,取下层澄清的萃取液,并通过0.22μm 的微孔滤膜进行过滤,室温氮气吹干,取100μL 甲醇复溶,3 000 r/min 离心5 min,取20μL样品HPLC进样检测瑞格列奈的血药质量浓度.采用Hypersil BDS C18色谱柱(46 mm×250 mm,5μm),流动相V(CH3OH)∶V(0.02 mol/L NH4H2PO4)=7∶3,调p H至2.5,1 m L/min流速,检测波长282 nm.峰面积(y)对血浆药物质量浓度(x,μg·m L-1)进行线性回归,标准曲线方程为y=8 768x-1.32×104(n=7,R=0.997),0.01～50μg/m L内线性关系良好.取已禁食12 h,自由饮水的健康Wistar大鼠6只,随机分成2组,按10 mg/kg药物剂量给2组大鼠分别口服灌胃原料药滴丸和RPG-Arg复合物滴丸组.于0.083、0.25、0.5、1,2、4,6、8、12、24、36、48 h大鼠眼眶取血0.5 m L,置于含有肝素钠的EP管中,离心,-20℃冻存,按照上述方法处理样品后,采用HPLC法测定药物质量浓度,绘制药时曲线.

2 结果与讨论

2.1 滴丸处方的筛选

在滴丸制备过程中,由单一的PEG-4000或PEG-6000为基质制备的滴丸过软或过硬,滴制药液黏稠,不易成形,所以选择混合一定比例的PEG-4000和PEG-6000基质进行考察,滴丸的溶散时限和质量差异结果见表1.由表1可知:各组滴丸均在10 min内溶散完全,每组滴丸的质量变异系数均小于±5%,均符合《中华人民共和国药典》(2015版)相关规定,其中m(PEG-4000)∶m(PEG-6000)=4∶1时,制备的滴丸评价效果较好.

不同基质比例的RPG-Arg复合物滴丸的溶出曲线如图1所示,所有滴丸均在30 min内溶出.当滴丸基质质量比4∶1时,药物溶出速度最快,累积释放最佳,在10 min累积释放80%,而其他比例滴丸仅释放60%～70%.因此选择m(PEG-4000)∶m(PEG-6000)=4∶1为制备滴丸的质量比例.

表1 不同基质质量比的滴丸溶散时限和质量差异Tab.1 Dissolution time and weight difference of dropping pills with different matrix ratios

图1 不同基质质量比RPG-Arg复合物滴丸的体外溶出曲线Fig.1 Dissolution profiles of RPG-Arg complex dropping pills with different matrix ratios in vitro

2.2 滴丸的物理表征

RPG-Arg和RPG 2种不同滴丸的DSC曲线见图2.瑞格列奈(图2a)在135℃处出现吸热熔融峰[9],药物与PEG 基质的物理混合物(图2c),在71℃出现与PEG 基质(图2b)相同吸收峰.而瑞格列奈滴丸DSC曲线中(图2d),熔融峰偏移至75℃,且瑞格列奈的晶体特征峰消失,推测滴丸中药物转化为非晶型,以无定型态存在.在RPG-Arg复合物滴丸DSC 图谱中,精氨酸(图2e)在225℃和243℃处出现其晶体的特征熔融峰,物理混合物(图2f)样品与RPG-Arg复合物滴丸(图2g)获得相似的DSC图谱,推测RPG-Arg冻干粉质量在滴丸质量中占比小,故瑞格列奈药物和精氨酸的DSC特征峰极弱,DSC图谱中药物和精氨酸熔融峰均消失.相比71℃PEG 基质DSC 特征吸热峰,物理混合样品(图2f)和RPG-Arg复合物滴丸(图2g)的DSC图谱的吸热峰偏移至67℃,推测药物与富含羟基的PEG 基质或富含氨基的精氨酸混合,利于分子间氢键的生成,促使药物结晶态改变,利于转化为无定型态.综上,瑞格列奈滴丸和RPG-Arg复合物滴丸,药物与PEG 基质均可形成氢键,利于其固体分散体形式的滴丸剂制备[10].

图2 滴丸的DSC图谱Fig.2 DSC thermograms of dropping pills

2种不同滴丸制剂的FTIR 图谱如图3所示.瑞格列奈(图3a)在3 308 cm-1和1 687 cm-1处为其分子上氨基和羰基的特征吸收峰[11].对比空白基质(图3b),瑞格列奈和空白基质的物理混合(图3c)图谱中,药物氨基和羰基与富含羟基的PEG 基质相互作用,特征峰发生红移.而在瑞格列奈滴丸(图3d)红外图谱中药物氨基和羰基特征峰强度明显减弱,药物分子与PEG 分子间氢键作用,抑制瑞格列奈晶体形成,推测药物以无定型状态存在.在RPG-Arg复合物滴丸表征谱图中,精氨酸(图3e)在3 296 cm-1和3 072 cm-1处的特征吸收峰为分子中氨基和羧基,形成分子内氢键,而1 685 cm-1处是羰基的特征吸收峰.相比空白PEG 基质(图3b),物理混合(图3f)和RPG-Arg复合物滴丸(图3g)图谱中精氨酸分子内氢键特征峰消失,瑞格列奈(图3a)的3 308 cm-1氨基吸收峰变宽且发生迁移,而1 687 cm-1羰基特征峰消失,即药物与精氨酸的特征峰基本消失,说明RPG-Arg复合物滴丸中药物、精氨酸和基质间存在强氢键作用,促使药物在PEG 基质中以无定型态均匀分散.而RPG-Arg复合物制备,可使药物与精氨酸先充分形成无定型态,与PEG 基质熔融混均,骤冷后成丸,此工艺比简单物理混合(图3f),更利于药物以无定型态分散.红外测试的结果与DSC结果相一致.

图3 滴丸的红外光谱Fig.3 FTIR spectra of dropping pills

2.3 体外释放实验

瑞格列奈滴丸和RPG-Arg复合物滴丸在p H 7.4的PBS缓冲体系中药物溶出曲线见图4.RPG-Arg复合物滴丸释放药物速度显著优于原药滴丸,10 min累积释药率达80%；而原药滴丸达到此累积释放率,需要30 min；故RPG-Arg复合物滴丸中存在精氨酸可加速药物溶出.RPG-Arg复合物滴丸体外释放优于原料药滴丸的原因,其一、采用助溶联合固体分散技术制备RPG-Arg冻干粉,RPG 分子通过氢键等作用,使得药物分子分散于精氨酸分子中,此分散可抑制药物和精氨酸晶态,获得药物的无定形态,利于药物溶出；其二、药物载体采用一定比例的PEG-4000和PEG-6000混合的亲水高分子,起到增大难溶药物的亲水性、分散性和润湿性,可促进难溶药物溶出.

图4 瑞格列奈滴丸和RPG-Arg复合物滴丸溶出曲线Fig.4 Drug release from RPG-Arg dropping pills and RPG dropping pills in PBS buffer

2.4 瑞格列奈滴丸的大鼠体内药代动力学研究

图5为瑞格列奈滴丸和RPG-Arg复合物滴丸的大鼠体内药-时曲线.采用DAS 2.0软件处理药代数据,获得表2中2种自制滴丸大鼠口服给药后的药代动力学参数,两滴丸的大鼠药-时曲线均符合二室模型.由图5可知,相比瑞格列奈滴丸,大鼠口服RPG-Arg复合物滴丸的药物吸收速度更快,药物达峰时间(tmax)提前了3 h,可达到速效降糖的效果.RPG-Arg复合物滴丸的达峰浓度(ρmax)约为RPG 滴丸的2倍.此外,RPG-Arg复合物滴丸的药时曲线下面积(AUC0-t)更大.根据公式(2)可计算复合物滴丸相对生物利用度为1.9.结果表明:RPG-Arg复合物滴丸能够改善药物溶解度和生物利用度.

其中,AUC代表血药浓度-时间曲线下面积,下标RGP-Arg和RGP分别代表复合物滴丸制剂和瑞格列奈原料药滴丸参比制剂,Dose代表给药剂量.

图5 口服10 mg/kg剂量瑞格列奈药物的大鼠药-时曲线(n=3)Fig.5 Average plasma concentration-time curves after oral administration of RPG drop pills and RPG-Arg dropping pills at a dose of 10 mg/kg in wistar rats(n=3)

表2 RPG 滴丸和RPG-Arg复合物滴丸大鼠口服给药后体内药代动力学参数Tab.2 PK parameters after oral administration of the RPG and RPG-Arg dropping pills

3 结论

本文选择PEG-4000和PEG-6000混合基质,成功自制瑞格列奈和RPG-Arg复合物滴丸.FTIR和DSC结果显示,2种滴丸中瑞格列奈以无定形态分散,体外释放显示自制RPG-Arg复合物滴丸更利于药物溶出.大鼠口服滴丸的体内药代动力学参数显示,RPG-Arg复合物滴丸体内吸收优于原药滴丸.实验显示,采用助溶联合固体分散技术制备RPG-Arg复合物后再次固体分散其于亲水高分子载体PEG-4000和PEG-6000混合基质中,可充分保证RPG无定形态的存在,促进药物溶出,改善难溶药物体内生物利用度.此实验结果可为瑞格列奈滴丸剂型的开发提供必要实验数据支持.