基于非靶向代谢组学研究做青工序对肉桂茶代谢产物的影响

林馥茗，孙威江

（1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362000；3.福建省茶产业工程技术研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】肉桂是福建闽北乌龙茶的代表，因其浓郁的花果香而深受消费者的喜爱，而乌龙茶加工过程中的做青工序是形成其品质特征的关键工序。逆境胁迫能够促进物质间的转化，并诱导生成次生代谢产物。茶叶加工也是一种人为干预性胁迫，尤其在做青环节发生了复杂的代谢变化，从而产生并积累大量的芳香物质等次生代谢产物，为此研究做青对乌龙茶品质形成的作用机制，可为乌龙茶生产提供理论参考。代谢组学是研究生物体在受到外界刺激等条件下，其代谢产物的变化情况及代谢途径，以阐述生物体对应刺激的响应机制[1-2]。运用代谢组学分析技术可以获得大量的生化数据，通过代谢组学分析技术探究加工工艺对茶叶品质的影响机制已成为研究热点。【前人研究进展】代谢组学分析技术能够深入了解茶叶在加工过程中发生的化学变化，已在红茶、绿茶、乌龙茶、白茶及黑茶方面均有相关研究[3-7]。Fraser等[8]利用LC-MS检测技术分析乌龙茶加工过程中代谢物的变化，结果表明在杀青阶段会导致主要生物化学物质发生改变，如类黄酮、核苷、樱草糖苷；做青过程中只有少量物质被标记，氨基酸和茉莉酸以及相关代谢物有显著的增加。Chen等[9]在铁观音乌龙茶加工过程中，检测到挥发性物质及非挥发性代谢物，如黄酮醇苷、氨基酸、萜烯类化合物等。Liu等[10]分析乌龙茶制作过程中挥发性和酚类化合物的动态变化，黄酮醇、酚酸和黄嘌呤生物碱的变化相对稳定，醛、酮、杂环化合物则主要是在烘焙过程中形成。通过代谢组学鉴别茶树品种[11-12]、产地[13-14]、年份[15-16]及品质评价[17-19]等均有报道，能够为指导茶叶加工生产提供理论基础。【本研究切入点】目前多数研究主要集中在茶叶加工过程中次生代谢途径及相关产物的变化，对初生代谢产物研究较少，而这些物质在植物中对环境胁迫防御适应起重要作用，同时也影响下游次生代谢物质的合成。【拟解决的关键问题】为此本研究通过GC-TOF-MS非靶向代谢组学检测技术，对做青前后及对照样品中糖类、有机酸等代谢产物的影响，筛选鉴定差异代谢物并探讨可能影响的代谢通路，为深入了解乌龙茶品质形成的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取同一片长势一致的无性系肉桂茶园，采摘春季中开面3、4叶茶梢为试验材料，且取自同一采摘批次的鲜叶，试验地点为武夷星茶业有限公司九龙山基地。

1.2 样品收集

为尽可能保证样品的代表性，本试验按照“看青做青”的原则，按照武夷岩茶的制作工艺（鲜叶→晒青→做青→杀青→揉捻→干燥），采用手工摇青的方式制作样品。取20 kg鲜叶经适度晒青后平均分为2组，一组进行手工摇青，具体操作如下：第1次摇青10转，第2次摇青20转，第3次摇青40转，第4次摇青60转，第5次摇青80转，第6次摇青120转，第7次摇青300转，中间晾青1 h，做青时间历时8 h左右；同时在相同环境条件下另一组茶青为对照组，即无摇青的摊放处理（摊青），摊放时间与做青时间一致；做青间温度23～25 ℃，相对湿度60%～70%。待做青结束后2组茶青经杀青、揉捻、烘干后制成毛茶，处理组与对照组除做青工序外，其余工艺参数均一致，试验重复3次。本试验分别对晒青叶（SYM）、做青叶（LY7M）及对照组摊青叶（CK7M）进行随机取样，取茶梢驻芽第2叶，用液氮迅速冷却固定，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 试剂与设备

本试验的主要试剂包括：核糖醇（≥99%，SIGMA）、甲氧铵盐（AR，TCI）、吡啶（HPLC，Adamas）、甲醇（HPLC，Adamas）、饱和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer）、BSTFA（with 1% TMCS，V/V，REGIS Technologies）、纯水等。本试验所用仪器与设备主要有真空干燥仪（TNG-T98，太仓市华美生化仪器厂）、超声仪（PS-60AL，深圳市雷德邦电子有限公司）、研磨仪（JXFSTPRP-24，上海净信科技有限公司）、固相微萃取头（65UM PDMS/DVB，上海安谱实验科技股份有限公司）、多功能进样器（MPS，德国Gerstel公司）、离心机（Heraeus Fresco17，赛默飞）、色谱柱（DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm，美国LECO公司）、质谱仪（PEGASUS HT，美国LECO公司）、气相色谱（7890A，Agilent）、超低温冰箱（Forma 900 series，赛默飞）等。

1.4 代谢物的提取

取样品（50 ±1 ）mg 于 2 mL EP 管中，以体积比V（甲醇）：V（水）=3∶1加入0.45 mL 提取液和10 μL 核糖醇，涡旋30 s；再加入瓷珠，用研磨仪（45 Hz）处理4 min，超声5 min（冰水浴），重复3次；将样品于4 ℃、12 000 g离心15 min，取0.3 mL上清液于1.5 mL EP 管中，在真空浓缩器中干燥，向干燥后的代谢物加入90 μL 甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg·mL-1），轻轻混匀后，放入80 ℃烘箱中，孵育30 min；向每个样品中加入100 μL BSTFA，将混合物在70 ℃孵育1.5 h，再随机顺序上机检测。每个样本均有6个生物学重复。

1.5 代谢物的检测

GC- TOF-MS非靶向分析条件如下：进样量为1 μL；隔垫吹扫流速为3 mL·min-1；分流模式为Splitless Mode；载气为氦气；柱箱升温程序为50 °C保持1 min，再以 10 °C·min-1升到 310 °C，保持 5 min；柱流速为 1 mL·min-1；离子源温度为250 °C；传输线温度为280 °C；前进样口温度为280 °C；电离电压为-70 eV；扫描速率为 20光谱·s-1；质量范围为50～500 m/z；溶剂延迟为6.27 min。每个样本均设6个生物学重复。

1.6 数据分析

使用ChromaTOF 软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。使用了 LECO-Fiehn Rtx5 数据库进行物质定性，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。利用归一化后的数据矩阵进行多元统计分析，并利用多元统计分析（OPLS-DA） 和单变量统计分析相结合的方法筛选差异代谢物，将差异代谢物进行代谢通路KEGG 富集分析。

2 结果与分析

2.1 样品间代谢物统计分析结果

由于加工取样影响因素较复杂，用无监督的主成分分析法（PCA）对组间样品分离效果不理想（图1），本试验采用正交偏最小二乘判别法（OPLSDA）对样品间进行分析，去除组内不相关差异，结果如图2~4所示，样品SYM与CK7M、SYM与LY7M、CK7M与LY7M间都显示出一定分离度，说明样品间代谢物具有差异。

2.2 样品间差异代谢物筛选

根据多元统计分析OPLS-DA的VIP值，并结合单变量统计分析t检验P值筛选不同比较组间的显著差异代谢物，以VIP≥1 且t-testP＜0.05为筛选条件确定差异显著的代谢物；通过公共数据库与公司自建数据库对代谢物进行定性，鉴定出的差异代谢物如表1所示，处理间差异代谢物变化倍数＞1。与晒青叶SYM相比，对照CK7M与做青叶LY7M差异显著的代谢物中上调者居多，分别有19个和14个，下调的产物分别有2个和0个，说明长时间的机械力和细胞失水的胁迫作用使叶片内代谢途径发生显著变化；与对照CK7M相比，做青叶LY7M中呈显著上调的差异代谢物有9个，显著下调的差异代谢物有3个。

表1 样品间差异代谢物的筛选Table 1 Differential metabolites in samples

2.3 样品间差异代谢物KEGG富集分析

将所得到的全部差异代谢物进行KEGG富集分析，如图5所示，差异代谢物主要涉及到的代谢途径有糖类代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、其他次生代谢的生物合成、能量代谢、核苷酸代谢、其他氨基酸代谢及萜类和聚酮类化合物代谢等。

2.4 样品间 GC-TOF-MS非靶向差异代谢物比较

通过与KEGG数据库比对，能够比对上通路的差异代谢物不多，通过GC检测到的差异代谢物主要是有机酸与糖类物质，晒青叶SYM与对照摊青叶CK7M间比对上的差异代谢物是硫磺酸、琥珀酸、莽草酸、柠檬酸、苹果酸、苯丙氨酸、苏糖酸、肌醇、熊果苷、棉子糖；晒青叶SYM与做青叶LY7M间比对上了7个差异代谢物，分别是琥珀酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、苏糖酸、苹果酸、肌醇、麦芽糖；对照摊青叶CK7M与做青叶LY7M间比对上8个差异代谢物，分别是硫磺酸、琥珀酸、柠檬酸、莽草酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、苏糖酸、棉子糖。

通过热图展示比较组间差异代谢物情况，如图6~8所示，肉桂鲜叶经做青及摊青后，大部分代谢物含量要高于晒青叶，其中琥珀酸、柠檬酸、苹果酸是三羧酸循环途径的中间产物。三羧酸循环是糖、脂类和氨基酸代谢的最后共同途径，该循环的中间体可参与到其他代谢途径中，直接利用三羧酸循环中间产物的生物合成途径有葡萄糖生物合成、脂类生物合成、氨基酸生物合成[20]。做青及摊青过程的机械损伤与失水作用可以增加三羧酸循环的中间产物，能够为次生代谢产物的合成提供前体物质和化学动力。做青结束时，叶片中琥珀酸和柠檬酸含量高于对照摊青叶，莽草酸含量明显减少。莽草酸是莽草酸途径中的关键中间产物，莽草酸在酶的催化下可以生成苯丙氨酸[21]。苯丙氨酸代谢途径是茶树次生代谢重要的途径之一，能够合成苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物[22]。本试验中检测到做青叶中苯丙氨酸含量有一定程度增加。另外，在试验中还检测到部分糖类物质，参与蔗糖代谢和半乳糖代谢，均在做青与摊青后明显增加，糖类物质是植物体初生代谢合成的重要物质，而环境胁迫作用能够在一定程度上促进糖类代谢活动。

3 讨论与结论

茶叶加工过程中不同程度的非生物胁迫和生物胁迫等防御作用是诱导和促进各类化合物合成的重要因素[23-25]，尤其是在乌龙茶做青过程中，因机械损伤和失水的双重胁迫下，叶片内含物质发生了显著变化，最终形成了乌龙茶的品质特征。Liu等[10]分析了肉桂乌龙茶加工过程中挥发性和酚类化合物的变化，在做青过程中78% 左右的黄烷醇被氧化形成茶黄素等产物，而黄酮醇、酚酸和黄嘌呤生物碱保持稳定，醛、酮和杂环化合物等主要是在烘烤过程中形成。唐邦明等[26]通过UPLC-QTOF/MS检测技术分析了乌龙茶加工过程中代谢物的变化，筛选出的差异代谢物包括牡荆素-2-O-鼠李糖苷、14,15-脱氢还阳参油酸、3-甲基黄嘌呤、麦黄酮、7-甲基黄嘌呤、枸橘苷、葡萄糖-6-磷酸，富集到的代谢途径主要是氨基酸合成、淀粉与蔗糖代谢、类黄酮生物合成等。本研究通过KEGG富集分析表明差异代谢物涉及的途径主要是糖类代谢、氨基酸代谢、脂类代谢等，与前人研究基本一致。在制茶环节中，非生物胁迫作用能够促进叶片中的多糖转化为双糖、单糖，随后进入次级代谢途径[27]；蛋白质可以水解形成氨基酸，而氨基酸类又参与氧化还原调节、信号传导、其他次级代谢产物的合成等[28]，对茶叶风味品质的形成有重要作用。

本研究结果显示在相同环境及时间条件下，做青工序能够明显增加三羧酸循环途径的中间产物，而这些产物能够参与糖类、氨基酸、脂类等物质合成，从而间接影响茶叶的品质。与对照相比，做青后叶片中莽草酸含量呈下调趋势，而苯丙氨酸含量有所增加。莽草酸是合成苯丙氨酸的前体物质，苯丙氨酸则参与生成了苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物。莽草酸途径连接了初生代谢与次生代谢，也是芳香族化合物合成的必经途径。本试验中武夷肉桂经做青后叶片中芳香族香气物质有显著增加（其含量是对照组的1.67～2.94倍），与前人研究结果基本一致[29-30]。芳香族化合物是乌龙茶具有花果香特征的重要物质，因此，推测做青工序能够增强莽草酸的代谢速度，为次生代谢物质的合成提供前体物，同时也促进苯丙氨酸代谢，生成芳香族化合物，其机理有待进一步明确。

乌龙茶是福建省特色茶类，具有愉悦的花果香和醇厚、回甘的口感，做青是品质形成的重要工序。前人研究主要是关注做青过程次生代谢产物的变化，本试验则从初生代谢角度探讨做青对乌龙茶品质形成的影响；不足之处是做青过程初生代谢产物的变化尚不明确，后续可结合多组学（转录组、蛋白组、代谢组）联合研究分析技术，深入研究做青对茶叶初级代谢与次级代谢的影响，明确做青对茶叶品质形成的作用机制，为茶叶加工工程基础研究和工艺的改良提升提供可靠的理论依据。目前做青方式仍以摇青与晾青交替进行，操作较复杂且难掌握，结合前人研究结果可知做青过程中的机械作用能够增强糖类、氨基酸、脂类、芳香物质等代谢合成，因此可采用连续慢速摇青方式对做青工序进行改良，既能促进乌龙茶品质形成，也能简化工序、节约成本[31]。