基于网络药理学和分子对接研究牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的作用机制

张 涛， 马书杰， 叶 斌， 严隽陶*

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海市第二康复医院，上海 201900；3.上海市第三康复医院，上海 200070)

膝骨关节炎是以膝关节周围关节软骨退变和继发性骨反应为特征的关节疾病，在60岁以上的老年人中致残率超过20%[1]，不仅会影响患者的身心健康，还增加了医疗系统和社会的经济成本[2]。目前，临床常用的短期对症治疗药物主要为非甾体类抗炎药，但其心血管风险、上消化道刺激、出血等不良反应明显[3]。研究证实，中医药在膝骨关节炎的防治中具有较好的疗效，而且不良反应相对较少，临床应用广泛[4]。

中医理论中将膝骨关节炎归属为“骨痹”“膝痹”范畴，其发病多因年老体衰、肝肾亏虚而致筋骨失于濡养，或因风寒湿热之邪流注肌肉、筋骨、关节而致经络痹阻，气血运行不畅，肢体筋脉拘急而发病。牛膝与杜仲皆入肝、肾经，均可补肝肾、强筋骨，前者还可逐瘀通经，后者还能祛除关节湿邪，二药合用可补益肝肾以治本，化瘀化湿以治标。现代研究也显示，牛膝-杜仲药对是膝骨关节炎治疗中使用频率最高的药对之一[5]，但迄今为止尚无该药对治疗膝骨关节炎的相关机制考察。因此，本研究采用网络药理学预测牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的潜在作用靶点和信号通路，并结合分子对接技术进行验证，以期系统全面地揭示药物与疾病间的关系，并为相关临床应用和机制研究提供新的证据和思路。

1 材料和方法

1.1 数据库、软件及分析平台 详见表1。

1.2 活性成分及其作用靶点筛选 使用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)筛选牛膝-杜仲药对活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug like，DL)≥0.18为筛选条件，将筛选出的活性成分与其潜在作用靶点进行配对，通过Uniprot数据库转换出作用靶点的通用基因名称，未被转换的靶点使用手动检索，最后去除重复基因，即为活性成分作用靶点。

表1 数据库、软件及分析平台

1.3 膝骨关节炎疾病靶点预测 以“knee osteoarthritis”为搜索词，在GeneCard、OMIM数据库中搜索人类膝骨关节炎的相关基因，合并去除重复项后获得膝骨关节炎相关靶点。

1.4 药物-疾病交集靶点基因数据库构建 使用在线BMK Cloud平台，将牛膝-杜仲药对药物活性成分作用基因与膝骨关节炎基因取交集，并绘制交集基因的维恩图。

1.5 药物-疾病交集靶点蛋白互作网络构建 在STRING数据库中进行交集靶点的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络分析，使用Cytoscape中的“Network analyzer”插件，通过拓扑学分析计算出PPI网络各靶点节点的度值(Degree)，根据节点度值大小选定网络中关键靶点基因，度值越大，该基因在PPI网络中的作用越大。

1.6 GO、KEGG富集分析 利用DAVID数据库对核心靶点进行基因本体论(gene ontology，GO)富集分析，探寻牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的生物功能。通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，探究牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的主要信号通路，P<0.05表示差异具有统计学意义。

1.7 “药物-活性成分-靶点-通路”拓扑网络构建 使用Cytoscape 3.7.2软件构建牛膝-杜仲药对与膝骨关节炎交集靶点的“药物-活性成分-靶点-通路”调控网络，“Network analyzer”插件进行网络拓扑参数分析得出上述网络中节点的度值，根据度值大小确定重要活性成分和靶点。

1.8 活性成分与靶点蛋白的分子对接验证 从PDB数据库下载关键靶点蛋白3D结构，从TCMSP平台下载主要活性成分mol2文件，然后使用PyMOL软件对关键靶点蛋白进行去水、加氢等操作，通过AutoDockTools 1.5.6、AutoDock Vina软件进行分子对接，记录结合能。

2 结果

2.1 活性成分及作用靶点 牛膝-杜仲药对活性成分共323种，其中牛膝176种，杜仲147种，按照口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18进行筛选后，最终确定牛膝活性成分17种，杜仲活性成分21种，见表2。同时，筛选出牛膝-杜仲药对作用靶点共234个。

2.2 膝骨关节炎疾病靶点预测 合并GeneCards、OMIM数据库中有关膝骨关节炎的基因，去除重复项，获得疾病相关基因靶点3 090个。

2.3 药物-疾病交集靶点基因数据库构建 使用在线BMK Cloud平台，获得牛膝-杜仲药对与膝骨关节炎的药物-疾病交集靶基因共132个，见图1。

2.4 药物-疾病交集靶点蛋白互作网络构建 通过STRING数据库将132个交集靶点以最低要求互动得分0.7为筛选参数分析，最终得出778条边和132个节点。采用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”蛋白互作网络，Network Analyzer工具分析网络中节点的度值，节点大小和颜色深浅反映度值大小，根据其排序确定核心靶点(图2)，度值排名前10的蛋白见表3，可知这些靶点在PPI网络中起着关键的作用，即为牛膝-杜仲药对有效成分调控膝骨关节炎的关键靶点。

2.5 GO、KEGG富集分析 将132个交集靶点基因上传到DAVID在线数据库进行GO富集分析，得到具有统计学意义(P<0.05)的GO条目共749条，其中生物学进程(biological process，BP)585条，细胞组分(cellular component，CC)62条，分子功能(molecular function，MF)102条，靶点基因主要参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对缺氧的反应、炎症反应、对细胞增殖、凋亡的调控等生物学进程等；主要在细胞外基质、线粒体、核浆、胞质等细胞组分处发挥作用，参与的分子功能主要包括蛋白、蛋白激酶、以及转录因子的结合等。图3展示了每个模块P值最小的前10个条目，其值越小，颜色越偏向红色，反之则偏向蓝色；点的大小表示富集的基因数。KEGG分析显示，靶点基因富集了108条相关通路，图4列出了P值排序最小的20个条目。另外，靶点基因主要涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、破骨细胞分化、Toll样受体信号通路、细胞凋亡以及Nod样受体通路等，与细胞的凋亡、增殖、分化、转化以及氧化应激、炎症反应等密切相关。

表2 牛膝-杜仲活性成分

2.6 药物-活性成分-靶点-通路调控网络构建 图5(颜色越深，度值越大)显示，度值排名前5位的化合物分别是MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000173(汉黄芩素)、MOL002714(黄芩素)、MOL002773(β-胡萝卜素)。

2.7 活性成分与靶点蛋白的分子对接 选择疾病-活性成分-靶点-通路调控网络及PPI网络分析结果度值排名前5的活性成分，与靶点基因进行分子对接验证，使用AutoDock软件进行结合能力预测，构象越稳定，结合能越低，通常结合能<0 kcal/mol提示分子之间具有结合活性，<-5.0 kcal/mol提示分子之间具有较强的结合活性[6]。将5种活性成分与5个靶蛋白对接后，发现槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素与AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF均有较好的结合能力，见表4。再采用PyMOL软件对靶点蛋白与成分对接的最佳构象进行可视化分析，直观展示其构象关系，以槲皮素为例，见图6。

表3 药物-疾病核心靶点基因

表4 药物-疾病核心靶点基因

3 讨论

本研究采用网络药理学探究了牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的现代分子生物学以及药理学机制。结果显示，牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的潜在靶点共132个，核心靶点包括IL6、TP53、AKT1、VEGFA、MMP9等，并可能通过参与氧化应激反应、炎症反应、对细胞增殖、凋亡的调控等生物学进程，影响蛋白、酶、转录因子的结合等分子功能[7]。TP53便具有抑制DNA复制，阻断细胞周期，导致细胞凋亡，加速软骨降解的作用[8]，细胞实验证实牛膝提取物可以在体外抑制大鼠变性软骨细胞中p53的表达[9]。AKT1是PI3K信号通路中重要的下游靶点激酶，其参与的PI3K/AKT信号通路是抗软骨细胞凋亡的重要通路[10]。研究证实促炎因子IL-6在膝骨关节炎患者的关节液、滑膜，软骨下骨和软骨中表达升高。IL-6还可引起基质金属蛋白酶MMP9表达的升高，抑制蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成，加速细胞外基质的降解，并可通过激活破骨细胞在骨吸收中起关键作用[11]。VEGFA同样参与了膝骨关节炎软骨退变和骨赘形成等病理反应[12]，研究显示VEGFA可刺激血管内皮细胞分裂进而促进血管的新生，加速膝关节的营养物质的交换以及炎性产物的代谢[13]，促进软骨滑膜细胞的修复，此外VEGFA具有加速骨形成同时抑制骨吸收的作用[14]。

本研究显示，牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的有效成分主要为槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素以及β-胡萝卜素等，这些小分子成分大多具有抗氧化、抗炎以及软骨保护作用。槲皮素是一种具有抗炎、抗氧化作用的多酚类生物黄酮，研究表明其可清除活性氧自由基，改善机体的氧化应激[15]，缓解膝骨关节炎的临床症状，并可减缓大鼠关节炎的发展速度[16]，亦可抑制基质降解蛋白酶和炎性介质的表达，同时促进软骨合成代谢因子的产生，减轻膝关节软骨的降解以及软骨细胞的凋亡[17]，而黄芩素、山柰酚与槲皮素作用相似[18]。汉黄芩素已被证实可通过抑制炎性介质如IL6、COX-2等的表达，并降低基质金属蛋白酶如MMP-13、MMP9等的表达，发挥其抗炎及软骨保护作用[19]。β-胡萝卜素可用于治疗多种因衰老引起的退行性病变，已被证实可通过抑制NF-κB信号通路抑制炎性因子的表达[20]。

牛膝-杜仲药对在治疗膝骨关节炎的靶点蛋白涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、破骨细胞分化、Toll样受体信号通路等，与软骨细胞的凋亡、分化及氧化应激、炎症反应、骨的重塑与吸收等密切相关。TNF-α可与膜受体结合，激活转录因子NF-κB和MAPK信号通路，增强炎症反应进而诱导基质金属蛋白酶产生，并诱导IL6等炎症因子产生，加剧软骨的破坏[21]。HIF-1是维持软骨细胞稳态和支持细胞分化的重要因素[22]，研究表明HIF-1α可通过抑制β-catenin转录活性下调软骨细胞中MMP13的表达，从而延缓骨关节炎的疾病进展，缺乏HIF-1α则可加速软骨的分解代谢[23]。Toll样受体(TLR)是跨膜信号转导受体，研究显示，TLRs在膝骨关节炎软骨细胞中表达上调[24]，TLR1-7和TLR9在关节炎患者的滑膜中上调，而TLR4与关节炎的严重程度有关[25]，TLR2/TLR4信号通路诱导IL-1和MMPs表达，增加NO和PGE2的产生，加速蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的降解，导致关节软骨破坏，并促进膝骨关节炎的形成[26-27]。作为骨关节炎的重要治疗靶点，破骨细胞可参与骨吸收以维持骨重塑的动态平衡[28]，已有研究证实骨关节炎的形成与趋化因子诱导的破骨细胞分化异常有关[29]。分子对接显示，牛膝-杜仲药对关键活性成分与关键靶点蛋白结合时的结合能均小于0 kcal/mol，提示其结合活性较好，证实了牛膝-杜仲药对治疗膝骨关节炎的靶向作用。

综上所述，牛膝-杜仲药对在膝骨关节炎的治疗中可能涉及不同靶点和通路，并在调控细胞凋亡、软骨基质降解、炎症反应以及骨重塑中发挥治疗作用，延缓膝骨关节炎的进展，体现了中医药治疗膝骨关节炎多靶点、多途径的特点。