UPLC-Q-TOF-MS法分析猫爪草化学成分

2022-12-02黄华靖江洁怡肖观林曾志浩杨敏娟毕晓黎

中成药 2022年7期

黄华靖，江洁怡，肖观林，曾志浩，杨敏娟，毕晓黎*

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院，广东广州 510095；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095)

猫爪草为毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的干燥块根，其味甘、辛，性温，入肝、肺二经，具有化痰散结、解毒消肿的功效，用于治疗瘰疬痰核、疔疮肿毒、蛇虫咬伤，1977年开始收载于《中国药典》[1-2]，具有抗结核[3]、抗肿瘤[4]、抗炎[5]、抑菌、免疫调节、抗氧化等作用[6]，临床上常与其他药物联合治疗肺结核、淋巴结结核、肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌[6-10]、慢性乙型肝炎、甲状腺炎等[11-12]，化学成分有酯类、有机酸、黄酮、苷类、生物碱、挥发油、多糖、微量元素、氨基酸等[1]。目前，猫爪草活性物质尚未明确，质量标准报道也较少。

近年来，UPLC-Q-TOF-MS法在中药及其复方成分的定性鉴别中应用广泛，具有高分辨率、高选择性、高灵敏度等特点[13-14]。因此，本实验采用该方法对猫爪草化学成分进行快速分析，以期为进一步阐释其药效物质、作用机制、质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 ExionLC AC型液相色谱仪、X500R QTOF型质谱仪(美国Sciex公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Sorvall Legend Micro17R型微量离心机(美国Thermo Scientific公司)；XS205型电子分析天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试剂与药物没食子酸(110831-201204，纯度89.9%)、芦丁(100080-201409，纯度91.9%)、小檗碱(110713-201814)、原儿茶醛(110810-201007)对照品均购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸(Y-031-161227)、鞣花酸(R-004-170426)、咖啡酸(K-003-150730)对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；对羟基苯甲醛(PS010495)对照品购自成都普思生物科技有限公司；亚油酸(AF7060202)对照品购自成都埃法生物科技有限公司，纯度均大于98.0%。猫爪草于2019年8月购自河南省驻马店市，经广东省中医药工程技术研究院刘法锦研究员鉴定为毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的块根。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯(美国Fisher公司)；水为蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

2 方法

2.1 供试品溶液制备取猫爪草5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，加热回流2 h，放冷，用95%乙醇补足减失的质量，滤过，滤液减压浓缩，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备精密称取没食子酸、芦丁、原儿茶醛、小檗碱、原儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、对羟基苯甲醛对照品适量，甲醇制成质量浓度为50 μg/mL，即得。

2.3 色谱条件 Waters CORTECS UPLC T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～2 min，5%～15%A；2～8 min，15%～43%A；8～20 min，43%～65%A；20～37 min，65%～92%A；37～42 min，92%～98%A；42～45 min，98%A)；体积流量0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量1 μL。

2.4 质谱条件正负离子模式，扫描范围m/z100～1 000；雾化气、辅助气压力379.2 kPa；气帘气压力241.3 kPa；雾化温度500 ℃；毛细管电压5 500 V/-4 500 V；裂解电压100 V/-80 V；碰撞能量35 V。

2.5 数据库建立通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、SciFinder、PubMed、ChemSpider等平台，查阅相关文献，收集猫爪草中196个化合物、毛茛属植物报道的66个化合物，建立包括化合物名称(含英文名称)、分子式、相对分子质量、CAS号、分类的化学成分数据库。

3 结果

3.1 成分鉴定基峰离子色谱图见图1，共鉴别出37个化合物，包括20个有机酸，4个生物碱，3个酯类，2个香豆素，2个萜类，2个黄酮等，其中鞣花酸、小檗碱为首次从猫爪草中发现。通过查阅文献[13-33]和比对对照品，结合裂解规律、保留时间、精确相对分子质量，对化学成分进行结构鉴定，结果见表1。

3.2 有机酸包括化合物2～4、9、11～12、14、18、20、23～24、28～35、37。化合物2在负离子模式下的准分子离子峰为m/z169.013 7[M-H]-，脱去一分子COOH形成碎片离子m/z125.023 0，鉴定为没食子酸[13]。化合物14在负离子模式下的准分子离子峰为m/z300.998 8[M-H]-，脱去一分子CO2、一分子CO后得到m/z257.009 6、229.014 5，脱去两分子CO2、一分子CO后得到m/z185.024 6，鉴定为鞣花酸[33]。

3.3 香豆素包括化合物5、8。化合物5在正离子模式下的准分子离子峰为m/z163.039 0[M+H]+，脱去一分子CO、一分子H2O形成特征碎片m/z135.043 9、117.033 7、117.033 7，再脱去一分子CO，形成特征碎片m/z89.038 6；m/z92.025 4由准分子离子峰脱去两分子CO后再脱去一分子甲基形成，鉴定为伞形花内酯[18]。化合物8在负离子模式下的准分子离子峰为m/z177.019 5[M-H]-，二级质谱有m/z149.024 9、133.029 3、105.044 3的碎片离子，鉴定为秦皮乙素[19-20]，其裂解途径见图2。

表1 猫爪草化学成分

3.4 生物碱包括化合物15～17、22。原阿片碱为普罗托品类生物碱，母核大多数为含有羰基的十元环，丢失羰基和1个氢可形成2个六元环，同时容易发生Retro-Diels-Alder(RDA)反应和α裂解，再继续脱去羟基或水分子等取代基，其准分子离子峰为m/z354.133 8[M+H]+, 发生RDA裂解产生碎片m/z206.080 9、149.060 1，其中前者再发生RDA裂解，脱去1个OH产生碎片m/z189.078 5，鉴定为原阿片碱[30]，小檗碱为原小檗碱类生物碱，母核一般不发生裂解，裂解途径以小分子取代基的裂解为主，如m/z321.099 2、292.096 4、278.081 2为取代基裂解形成的特征碎片离子峰。化合物22准分子离子峰为m/z336.122 7 [M+H]+，脱去一分子CH3可产生碎片m/z321.099 2或m/z320.105 1，后者再脱去一分子CO产生m/z292.096 4碎片；脱去两分子CH3后，再脱去一分子 CO,可产生碎片m/z278.081 2，鉴定为小檗碱[31]，其裂解途径见图3。

3.5 萜类包括化合物27、36。化合物27在负离子模式下的准分子离子峰为m/z487.339 4[M-H]-，脱去一分子 H2O，生成碎片m/z469.333 7，再脱去一分子HCOOH产生碎片m/z423.329 7，鉴定为积雪草酸[14,26]，其裂解途径见图4。

3.6 黄酮黄酮苷元在质谱条件下裂解方式主要有CO、CO2、C2H2O、H2O等中性粒子的丢失，以及C环发生RDA裂解；黄酮苷则常发生糖基均裂，形成黄酮苷元离子[26]。化合物26在负离子模式下的准分子离子峰为m/z313.071 6[M-H]-，母离子丢失酰基得到碎片m/z271.061 5，再脱去一分子H2O得到碎片m/z253.050 5，鉴定为pinobanksin-3-O-acetate[25]。化合物13在负离子模式下的准分子离子峰为m/z609.147 0[M-H]-，脱去芸香糖基产生离子m/z301.035 7，鉴定为芦丁[32]。

4 讨论

4.1 分析条件优化本实验考察不同提取溶剂、不同处理方式、不同提取时间，发现提取溶剂为95%乙醇、回流提取、提取时间为120 min时各分析物提取效果最好，响应值较高，故最终确定以95%乙醇加热回流120 min作为供试品制备方法。在优化色谱条件时，考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸，结果表明，流动相为乙腈-0.1%甲酸时分离度好，色谱峰峰形较好，故以乙腈-0.1%甲酸为流动相。

4.2 化学成分分析猫爪草具有抗结核、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用[1]，其有机酸部位是发挥抗结核、抗肿瘤作用的活性成分之一[6]。采用 UPLC-Q-TOF-MS 技术检测猫爪草中的化学成分，共鉴定37个化合物，包括20个有机酸，4个生物碱，2个香豆素，2个黄酮，2个萜类，大部分为有机酸类，部分具有明确生理活性。例如，咖啡酸具有抗氧化、抗炎、抗癌、调节DNA甲基化水平、升高白细胞与血小板[34]等作用；鞣花酸具有良好的抗肿瘤、抗氧化、保护肝损伤、抗菌、抗病毒、抗过敏、镇静降压等作用[35]；没食子酸具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用，在心血管系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、肝纤维化等方面均有一定药理作用[36]。但目前猫爪草有机酸部位发挥抗结核、抗肿瘤作用的活性成分尚未明确，有待进一步研究。