基于整合药理学探讨复方板蓝根颗粒干预新型冠状病毒肺炎的作用机制

陆馨雨， 张泽宇， 司鹏飞， 秦路平， 王小艳

(浙江中医药大学，浙江 杭州 310000)

新冠肺炎病毒肺炎(COVID-19)是影响全球社会发展的重大公共卫生事件[1]。中医认为，COVID-19属于“寒湿疫”的范畴[2]，病因为湿毒[3]，病机为湿毒壅肺、阻遏气机，病位在肺，多涉及脾、胃，重症期可波及心、肾[4]。我国临床医生及科研团队尝试运用中医药经典方剂或现有中成药对新冠肺炎开展辨证施治，从中筛选抗新型冠状病毒的有效药物，复方板蓝根颗粒(FFBLG)是一种实验有效的阳性候选药物。

复方板蓝根颗粒的主要组成为大青叶与板蓝根，两者植物基源相同[5]。中医认为，这2味药物性味均苦寒，善能清热解毒，此外还具凉血、消肿之效，因而被历代医家广泛用于治疗各类传染性疫病(古称“天行”)，尤其是伴有出血、发斑或咽喉肿痛者。在现代临床治疗中，复方板蓝根颗粒主要用于风热感冒、咽喉肿痛等症。现代药理研究发现，板蓝根及大青叶对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、腮腺炎病毒、流感病毒、乙肝病毒等均有一定的抑制作用。本研究运用中医药整合药理学研究平台(TCMIP)V2.0[6]，旨在通过数据挖掘与分析，构建方剂-中药材-成分-核心靶标-通路-疾病多维关系网络，阐释复方板蓝根颗粒干预新型冠状病毒肺炎的潜在作用机制，为临床应用及新药开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 有效成分及相应靶标分析 采用TCMIP V2.0平台(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)，在“中药材数据库”模块中检索板蓝根、大青叶所有化学成分，根据结构类似的生物分子化合物具有类似的理化性质和生物活性原理，在TCMIP V2.0中采用化合物二维结构相似性搜索，通过与FDA上市药物进行Tanimoto系数计算相似性分值，预测有效成分相应靶标[7]。本研究选择相似性≥0.8作为筛选条件，得到有效成分预测作用靶标，并进一步数据标准化，自主创建数据集“复方板蓝根颗粒方剂库”。

1.2 COVID-19疾病靶标分析 TCMIP V2.0平台中疾病相关的靶标基因及其相关数据来源于基因相关性数据库(DisGeNET)、人类表型本体数据库(HPO)、Drugbank数据库、治疗靶标数据库(TTD)等[8]，本研究选择“疾病相关分子集及其功能挖掘”模块，根据COVID-19在临床上的3个主要症状，即“肺炎(pneumonia)”“发烧(fever)”“咳嗽(cough)”，挖掘获得相应的靶标基因，由此构建相关疾病靶标[9-10]。

1.3 干预COVID-19潜在作用靶标分析 采用Venn Diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，将“1.1”“1.2”项下所得复方板蓝根颗粒有效成分的靶标与COVID-19疾病靶标进行映射，从而获得干预COVID-19的潜在作用靶标。

1.4 靶点蛋白互作网络构建及核心靶标筛选 采用TCMIP V2.0平台中的“中医药关联网络挖掘”模块，得到靶点蛋白相互作用网络。在选择核心节点的基础上，以连接度(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)的中位数为卡值，以同时满足三者为条件筛选出核心靶标。

1.5 基因功能GO分析、信号通路Reactome Pathway富集分析 采用TCMIP V2.0平台中的“中医药关联网络挖掘”模块，对“1.4”项下所得核心靶标进行基因功能GO分析和信号通路Reactome Pathway富集分析，以P值升序排列，其值越小，分析可信度越高。

2 结果与讨论

2.1 有效成分与相应靶标预测 复方板蓝根颗粒中板蓝根、大青叶所含有效成分共39种，前者25种，后者24种；相应靶标389个，前者290个，后者336个。

2.2 COVID-19疾病靶标 根据COVID-19在临床上的3个主要症状，获得COVID-19相关的疾病靶标共258个。

2.3 干预COVID-19的潜在作用靶标 将“2.1”“2.2”项下复方板蓝根颗粒有效成分靶标与COVID-19疾病靶标映射取交集，共获得16个干预COVID-19的潜在作用靶标(图1)，包括VCP、ABCC2、ABL1、ADA、AK2、FBP1、HBB、NME1、PRKAR1A、TLR4、TP53、ACTA1、NFκB1、NFκB2、PNP、PRKCD。其中，AK2定位于线粒体的膜间隙，主要功能是作用于底物AMP，并通过催化可逆的磷酸基转移反应来激活ATP浓度敏感的信号通路[7,11]，在细胞凋亡及肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用[12]；NME1基因是一种肿瘤转移抑制基因，其启动子区rs16949649、rs3760468、rs3760469、rs2302254等单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点基因多态性与肺癌易感性和预后存在关联，SNPs基因突变可影响NME1基因启动子与转录因子的结合, 进而影响其转录和蛋白表

达，并影响肿瘤发生风险和预后[13]；TLR4主要通过激活核转录因子κB炎症通路后启动转录调控、炎症反应及免疫调节等作用[14]，与病源相关分子模式和损伤相关分子模式相结合，促进IL-6、IL-1、IFN-γ、TNF-α等免疫炎症因子分泌，进而趋化、激活巨噬细胞及中性粒细胞，导致呼吸道、肺泡及肺血管炎症反应产生[15]；TP53是编码肿瘤蛋白p53的抑癌基因，为人类多种癌症中最常见的突变基因之一[16]，其突变型可促进肿瘤细胞增殖、迁移、生存、侵袭，增强肿瘤细胞耐药性，破坏正常组织的生理结构，促进肿瘤细胞代谢[17]；NF-κB是一种广泛存在于真核生物内的转录因子，NFκB1、NFκB2为其家族成员，其通路在细胞增殖、存活、早期病毒应答及细胞因子分泌、促炎等方面具有重要作用[18]。根据交叉靶标目前已发现的功能特点来推测，复方板蓝根颗粒干预COVID-19时可能主要参与炎症反应、激活ATP、调节细胞凋亡、参加免疫反应、抑制细胞增殖分化、清理气道、改善通气等，通过修复或缓解肺损伤、咳喘、呼吸困难等主要症状起到防治作用。

2.4 干预COVID-19的多维关系网络 采用TCMIP V2.0的数据分析平台，构建复方板蓝根颗粒干预COVID-19的方剂-中药材-成分-核心靶标-通路-疾病多维关系网络，见图2。由此可知，干预作用主要与5种有效成分相关联，作用于17条主要通路的76个核心靶标，即能通过多途径、多靶标、多环节来干预COVID-19。

2.5 干预COVID-19的核心靶标网络 核心靶标共26个，见表1。其中，Akt1是PI3K途径中重要的分子，活化后可磷酸化下游多个细胞激酶[19]，PI3K/Akt信号通路是肿瘤研究的热门通路，在肺腺癌中被激活，并与低分化、进展期和淋巴结转移等相关，并且Akt1是肺腺癌预后的影响因素之一[20]；TSC1/2复合体位于PI3K-Akt下游，Akt磷酸化可通过抑制TSC1/TSC2的活性来对细胞增殖产生影响，同时TSC1对细胞的增殖具有调节作用[21-22]，TSC1表达升高有助于抑制人胚肺成纤维细胞的增殖与分化，对肺纤维化起到抑制作用[23]；IL10通过作用于不同的免疫细胞介导免疫抑制，使其产生相关细胞因子或抑制某些分子的表达，介导体内抗肿瘤免疫抑制，从而使机体出现细胞增殖失控、免疫逃逸[24-27]，主要由Treg、Breg细胞的某些特定亚型分泌抑制性调节因子，肺癌患者体内往往都存在不同程度的免疫抑制，两者作为肿瘤微环境的重要负性调节成分，介导免疫抑制[28]；IL-6/IL-10对重症肺炎具有较好诊断价值，可用于鉴别入院时重症肺炎，有助于筛查可能发生严重并发症的风险，对临床治疗具有一定指导意义[29]；JAK2激活后可使STAT的酪氨酸磷酸化，JAK2/STAT3信号通路的激活参与肺癌发生发展及机体细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[30-31]；BCL2位于线粒体外膜上，其家族在凋亡基因调控中起着重要作用[32]，主要通过促进抗凋亡基因的表达、抑制促凋亡基因表达、干扰线粒体膜的通透性来阻碍肺癌细胞凋亡。根据核心靶标目前已发现的功能特点推测，复方板蓝根颗粒可能参与炎症反应、调节细胞凋亡、参加免疫反应、抑制细胞增殖分化、抑制肺纤维化等，推测可能通过抗炎、调节免疫、修复肺功能等途径来干预COVID-19。

表1 复方板蓝根颗粒干预COVID-19核心靶标

2.6 核心靶标生物功能注释和通路富集 表2显示，复方板蓝根颗粒干预COVID-19主要通过影响细胞因子介导的信号通路、凋亡过程、蛋白质磷酸化、磷酸化、转录正调控、DNA模板、细胞对DNA损伤刺激的反应、B细胞增殖、凋亡过程的负调控、凋亡的调控、I-κB激酶/NF-κB信号传导、DNA损伤诱导蛋白磷酸化、基因表达的正调控、B细胞分化、对脂多糖的反应、病毒过程、细胞对机械刺激的反应、对UV-B的反应、细胞周期停滞、对γ射线的反应、B细胞活化等生物过程发挥作用。表3显示，复方板蓝根颗粒干预COVID-19主要通过影响白介素4和白介素13信号、IκBA变体导致EDA-ID、RHO GTPases激活NADPH氧化酶、磷酸化调节TP13活性、白介素7信号、ZBP1进行RIP介导的NFκB激活、白介素10信号、颗粒状外源抗原的交叉展示、RUNX2调节成骨细胞分化、TRAF6介导的NF-κB激活、白介素9信号、白介素23信号、TP53调节代谢基因、白细胞介素受体SHC信号、白介素12信号、MAPK3(ERK1)激活、白介素21信号、在NMDAR下游激活AMPK，LκB1-AMPK对mTOR的能量依赖性调节、白介素6信号等信号通路发挥作用。

表2 复方板蓝根颗粒干预COVID-19核心靶点GO功能分析(前20条生物过程)

表3 复方板蓝根颗粒干预COVID-19核心靶标的Reactome Pathway分析(前20条信号通路)

复方板蓝根颗粒干预COVID-19核心靶标的Reactome Pathway富集分析见图3，可知白介素信号通路较为主要。已有研究表明，白介素信号通路影响多种生物过程，如IL-13能够对气道炎症与免疫反应进行有效调节[33]；IL-7高表达与非小细胞肺癌分期、淋巴结转移和预后不良正相关[34]；IL-10是一种重要的抑炎性细胞因子，可参与机体的免疫功能和炎症过程，具有广泛的抑制炎性因子的作用[35]；IL-9和IL-10之间存在密切联系，两者相互作用影响，前者可作用于参与哮喘等多种疾病发病的炎症细胞中[36]；IL-17是由辅助性T细胞17(Th17)分泌的一种促炎症细胞因子；IL-23是一种促进Th17细胞产生IL-17表达的调节因子[37]；IL-12主要由抗原刺激的单核细胞/巨噬细胞产生, 可通过调控JAK-STAT信号通路分别诱导干扰素γ (IFN-γ)、IL-17表达，从而发挥促炎作用[38]；IL-21可促进IL-17的表达，两者协同作用时可诱导TNF-α、IL-6、GM-CSF等促炎因子，影响气道纤维结缔组织的形成和平滑肌的增生[39]；IL-6是早期炎症反应的细胞因子，由纤维母细胞、上皮细胞、单核/巨噬细胞及T、B淋巴细胞等产生，可诱导细胞毒性T淋巴细胞的增殖分化，增强自然杀伤细胞(NK细胞)活性，促使浆细胞分泌抗体，刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应[40]。因此，白介素信号通路多与肺部损伤、炎症与免疫反应有关。

3 结论

本研究基于TCMIP V2.0平台的数据挖掘与分析功能，获得并预测了复方板蓝根颗粒组方中两味中药的有效成分及其作用靶标，同时根据COVID-19的3个主要临床症状构建了COVID-19相关的疾病靶标，通过靶标映射、基因功能GO分析、信号通路Reactome Pathway富集分析等研究发现，复方板蓝根颗粒可能主要通过影响白介素信号通路等，以达到抗炎、调节免疫、调节细胞凋亡、抑制细胞增殖分化、修复肺部损伤等多方面的作用，从而起到干预COVID-19的综合功效。此外，根据新冠肺炎4个病期的证候以及临床表现[41]，本研究推测复方板蓝根颗粒可能对新冠肺炎的干咳、咳嗽喘憋、呼吸困难、动辄气喘或需要辅助通气等症状起到一定的干预治疗作用，适用于COVID-19各个病期阶段的治疗，相关的功效物质基础及其作用机制还有待进一步实验研究及临床验证。