基于网络药理学、分子对接和细胞实验探讨枸杞子防治老年性痴呆的作用机制

曾永长， 梁少瑜*， 姜倩倩， 吴俊洪， 刘常青， 宋力飞， 吴正治*

(1.深圳大学第一附属医院转化医学院，广东 深圳 518035；2.深圳市老年医学研究所，广东 深圳 518020；3.广州泽力医药科技有限公司，广东 广州 510663)

老年性痴呆也叫阿尔茨海默病，是一种典型的慢性中枢神经系统退行性疾病，其发病机制复杂，病因不明，临床一线用药以乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂为主，两者只能控制症状，不能终止病程发展，且具有严重的不良反应。以传统中药延缓轻度认知障碍向老年性痴呆的转化、终止甚至逆转老年性痴呆的发展进程的研究逐渐成为热点。

中医认为，老年性痴呆病位在脑，五脏虚损为本，尤以肾为要。肾虚精亏、髓海不足是痴呆的基本病机。肝肾同源，肾水不足则水不涵木，精血亏虚，肝肾俱损。枸杞子是卫生部批准的药食同源中药材之一，其味甘，性平，归肝肾经，有滋肝补肾、益精明目之功。药理研究显示，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、神经保护、保肝、抗肿瘤等作用。枸杞子能逆转Aβ神经毒性，减弱因同型半胱氨酸诱导的神经元细胞死亡，增加SOD活性，降低MDA水平，上调α7nAChR表达等发挥抗衰老、神经保护、抗阿尔茨海默病作用[1-3]，但其活性成分如何协同整合影响疾病网络尚未清楚。本研究拟采用网络药理学与分子对接相结合的方法，系统研究枸杞子防治老年性痴呆“活性成分-靶点-通路”的复杂关系，为枸杞子防治老年性痴呆的临床使用提供科学依据，为药食同源中草药大健康产品开发提供借鉴。

1 材料

1.1 试剂与药物 枸杞子(批号20210219)购自广州紫云轩药业有限公司。PC-12高分化细胞(批号PD20180827)、胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；TRIzol购自广州洪祥生物医药科技股份有限公司；RPMI 1640及引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 数据库与软件 中药系统数据库及分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；中药数据库@ Taiwan(TCM@Taiwan，http://tcm.cmu.edu.tw/)；中药整合数据库(TCMID, http://www.megabionet.org/tcmid/)；PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)；治疗靶标数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)；String 11.0(https://string-db.org/)；DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)；Protein Data Bank(PDB，http://www.rcsb.org/)；SYBYL-X1.3；Cytoscape 3.8.2。

2 方法

2.1 化学成分数据库构建 以枸杞子为关键词，检索TCMSP、TCM@Taiwan及TCMID数据库，获取其化学成分信息，遵循药物活性成分筛选条件，优选口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-like，DL)≥0.18者。另外，通过文献检索补充不在上述筛选范围内，但也具有明显生理活性的成分。

2.2 候选靶点及抗老年性痴呆潜在靶点预测 通过TCMSP和PubChem检索枸杞子候选活性成分的三维化学结构，保存为mol2格式，将其输入PharmMapper执行反向对接，以fit score≥3.5为条件，优化候选活性靶点。采用TTD、TCMSP数据库查找候选靶点对应的疾病，并将其分类“mild cognitive impairment，Alzheimer disease，dementia”的靶点作为枸杞子防治老年性痴呆的潜在靶点。

2.3 可视化网络、蛋白相互作用网络构建及相关靶点通路和生物信息学分析 分别将枸杞子“候选活性成分-候选靶点”，防治老年性痴呆的“潜在活性成分-潜在靶点-通路”关系导入Cytoscape，构建“候选成分-候选靶点(candidate compounds-candidate targets，cC-cT)”和“防治老年性痴呆潜在成分-潜在靶点-通路(potential compounds-potential targets-pathways，pC-pT-P)”可视化网络。将枸杞子作用靶点导入String，设定“Homosapiens，high confidence 0.7”，获取蛋白相互作用关系，将蛋白相互关系导入Cytoscape 绘制PPI网络，并筛选关键蛋白靶点，将枸杞子防治老年性痴呆的潜在活性靶点导入DAVID，进行 GO(gene ontology)和 KEGG(Kyoto encyclopediaof genes and genomes)分析。

2.4 活性成分-靶点分子对接研究 基于Tripos力场对活性分子进行能量优化，获得最低能量构象，建立枸杞子对接化合物库。PDB数据库下载HSD11B1、INSR、NR3C1、RARA、CASP3、MAPK14、GSK3B、NOS2晶体结构，在Dock Ligands中对蛋白晶体去水，加氢，能量优化，选择晶体本身的Ligand模式产生活性口袋，保存为sfxc格式。采用Surflex-dock模块对上述潜在活性成分和靶点进行分子对接及打分。

2.5 Aβ25-35诱导PC12细胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2、CASP3 mRNA表达检测 采用回流提取法制备枸杞子水提物，减压干燥成浸膏粉，得率约为56.87%，采用无菌水配制成10 g/L，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，临用前用无菌PBS分别稀释至5.0、1.0 mg/mL。采用RT-qPCR法，取对数生长期的PC12细胞，分为对照组、模型组及枸杞子水提物1.0、5.0 mg/mL组，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育24 h，弃去原培养基，加入相应药物溶液继续培养12 h，再加入Aβ25-35溶液使体系中Aβ25-35终浓度为25 μmol/L，继续培养24 h，各组细胞处理结束后PBS润洗，TRIzol裂解液使细胞充分裂解提取RNA，并转录成cDNA，特定引物(序列见表1)对各目的基因反转录后进行PCR扩增，反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，循环45次。以GAPDH为内参基因，2-△△CT法计算各基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列

2.6 Aβ25-35诱导PC12细胞CASP3蛋白表达检测 采用Western blot法，按“2.5”项下方法分组后作用于PC12细胞24 h，收集细胞，PBS润洗3次，加入裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，BCA法测定蛋白浓度。取各组蛋白40 μg，SDS-PAGE电泳，经转膜、封闭、洗膜后，加封闭液稀释的兔抗鼠一抗CASP3(1∶1 000)，在4 ℃下过夜孵育，TBST洗膜3次，每次15 min，加封闭液稀释的HRP标记二抗(1∶10 000)，室温下静置1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL显影，X光胶片曝光，洗片。

3 结果

3.1 枸杞子活性成分及靶点筛选 共获得枸杞子192种成分，满足OB≥30%、DL≥0.18者共46种，主要包括甾体、萜类、黄酮、含氮类等。此外，spermidine(亚精胺，OB=45.41%，DL=0.02)、cystadane(甜菜碱，OB=40.92%，DL=0.01)、neoxanthin(新黄质，OB=28.92%，DL=0.5)、cryptoxanthin(隐黄质，OB=25.16%，DL=0.57)、zeaxanthin(玉米黄素，OB=21.17%，DL=0.54)、lutein(叶黄素，OB=15.74%，DL=0.54)、vitamin C(维生素C，OB=13.34%，DL=0.04)。尽管OB或DL值较低，但考虑它们在药材中的含量及生理活性[4-7]，仍然保留其做进一步的靶点预测以确保实验周全性和准确性，具体见表2。

表2 枸杞子53种候选成分

将上述成分的mol2格式输入Pharmmapper，进行反向药效团匹配，共预测269个高匹配度靶点，其中与老年性痴呆相关的潜在靶点共31个，包括HSD11B1(11-β-羟化内固醇脱氢酶1)、RARB(β维甲酸受体)、NR3C1(糖皮质激素受体)、RARA(α维甲酸受体)、CALM1(钙调蛋白)、KIT(肥大/干细胞生长因子受体)、IGF1(胰岛素样生长因子)、F2(凝血酶原)、FGFR1(碱性成纤维细胞生长因子受体1)、MET(肝细胞生长因子受体)、MAPK10(丝裂原活化蛋白激酶10)、MAPK14(丝裂原活化蛋白激酶14)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)、PDE4D (cAMP特异性3,5-环磷酸二酯酶4D)、KDR(血管内皮生长因子受体2)、INSR(胰岛素受体)、F11(凝血因子XI)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、ESR2(β雌激素受体)、BACE1(β分泌酶)、HMOX1(血红素加氧酶1)、GSK3B(糖原合成酶激酶-3β)、ESR1(雌激素受体)、F7(凝血因子Ⅶ)、PPARD(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)、SOD2(超氧化物歧化酶)、PDE4B(cAMP特异性3,5-环磷酸二酯酶4B)、NOS2(一氧化氮合酶，诱导型)、RAC1(Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物)、MAOB(胺氧化酶B)、ACE(血管紧张素转换酶)。

3.2 枸杞子cC-cT网络构建、PPI网络分析及GO、KEGG富集分析 将53种候选成分和269个候选靶点的相互作用关系导入Cytoscape进行网络构建，得到“cC-cT”网络(图1A)，蓝色圆圈代表候选成分，红色菱形代表候选靶点，节点大小代表相应的度(Degree)，共322个节点和3 472条相互作用关系，平均相邻节点数21.57，充分体现枸杞子多成分、多靶点调控疾病的网络特征。“cC-cT”网络中Degree(D)最高的10种候选成分包括M49(neoxanthin，新黄质，D=131)、M35(cryptoxanthin monoepoxide，隐黄素环氧化物，D=126)、M02(31-norcyclolaudenol，去甲环鸦片甾烯醇，D=110)、M36(δ-carotene δ-胡萝卜素，D=97)、M33(β-carotene，β-胡萝卜素，D=95)、M50(cryptoxanthin，隐黄素，D=95)、M51(zeaxanthin，玉米黄质，D=95)、M41(physalin A，酸浆苦味素，D=93)、M52(lutein，叶黄素，D=91)、M04(cycloeucalenol，环桉烯醇，D=81)，Degree最高的10个候选靶点分别为MAP2K1、HNMT、RXRB、FECH、FABP7、SULT2B1、HSD11B1、CRABP2、RARB、PCTP，靶点与疾病的对应关系见表3(前10)，提示枸杞子与肿瘤、炎症、肝损伤、认知障碍、神经退行性疾病等密切相关。

表3 枸杞子10个关键候选靶点、拓扑参数及疾病对应关系

通过String构建枸杞子活性靶点相互作用网络(图1B)，共233个节点和918条相互关系。通过节点度≥15筛选枸杞子关键靶点，获得包括SRC、PIK3R1、HRAS、EGFR、HSP90AA1、MAPK14、GRB2、IGF1、PRKACA、RAC1、RXRA等31个蛋白，主要参与细胞免疫反应、调节ER应激和自噬、调控细胞周期和信号转导、反向调节抗病毒基因转录、调控树突棘形成、突触可塑性等生理过程。

以P<0.01为条件，枸杞子活性靶点GO富集分析共获得269条GO条目，包含180个生物过程(biological process，BP)、26个细胞组成(cellular component，CC)、63个分子功能(molecular function，MF)，见图1C(前10)，涉及类固醇激素介导信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始、肽基酪氨酸自磷酸化、蛋白质自磷酸化、凋亡过程负调控等生物学过程，发挥调节类固醇激素受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、ATP结合及酶结合等功能。以P<0.01为条件，枸杞子活性靶点KEGG通路富集分析共获得60条信号通路，涉及各类癌症、胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路等。

3.3 枸杞子防治老年性痴呆“pC-pT-P”网络构建及通路分析 将枸杞子防治老年性痴呆的“潜在活性成分-靶点-通路”相互作用关系导入Cytoscape进行网络构建，得 “pC-pT-P”网络(图2A)，共98个节点(50种活性成分、31个活性靶点、17条信号通路)和567条相互作用关系。通过Cytohubba设定Maximal Clique Centrality(MCC)为30，构建枸杞子防治老年性痴呆C-T关键子网络(图2B)及各关键节点得分图(图2C)，可知枸杞子防治老年性痴呆的关键活性成分包括M35-隐黄素环氧化物、M49-新黄质、M02-去甲环鸦片甾烯醇、M33-β-胡萝卜素、M36-δ-胡萝卜素、M50-隐黄素、M52-叶黄素、M14-钝叶醇、M18-羊毛甾醇、M07-环阿屯醇、M51-玉米黄质、M09-花色素苷等，关键靶点包括HSD11B1、NR3C1、RARB、CALM1、RARA、KIT、IGF1、F2、FGFR1、MET、MAPK10、CASP3、MAPK14等。KEGG通路富集分析(前10，图2D)显示，枸杞子防治老年性痴呆31个潜在靶点主要涉及癌症通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、神经营养因子信号通路、多巴胺能突触、HIF-1信号通路及炎症通路等。

3.4 分子对接研究 将枸杞子潜在活性成分neoxanthin(新黄质)、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隐黄素环氧化物)、δ-carotene(δ-胡萝卜素)、isofucosterol(异岩藻甾苷)、β-carotene(β-胡萝卜素)、cryptoxanthin(隐黄素)、zeaxanthin(玉米黄质)与老年性痴呆核心靶点HSD11B1-2ILT、INSR-5ELS、NR3C1-3BQD、RARA-3kmr、CASP3-1gfw、MAPK14-6sfo、GSK3B-6hk4及NOS2-4nos进行分子对接，结果见表4、图3。其中，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隐黄素环氧化物)、cryptoxanthin(隐黄素)对HSD11B1，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隐黄素环氧化物)、cryptoxanthin(隐黄素)、δ-carotene(δ-胡萝卜素)对INSR，β-carotene(β-胡萝卜素)、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隐黄素环氧化物)对CASP3，cyanin(花色素苷)对GSK3B，δ-carotene(δ-胡萝卜素)对NOS2结合得分大于6.0且配体与受体对接时不适程度较小，结合良好。

表4 枸杞子防治老年性痴呆关键活性成分与靶点对接得分

3.5 枸杞子水提物对Aβ25-35诱导PC12细胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2及CASP3 mRNA表达的影响 所选引物特异性良好，见图4A。与对照组比较，模型组GSK3B、MAPK14、NOS2及CASP3 mRNA表达升高(P<0.05)，ESR1 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物组可抑制GSK3B、NOS2、CASP3 mRNA表达(P<0.05)，上调ESR1 mRNA表达(P<0.05)，见图4B。

3.6 枸杞子水提物对Aβ25-35诱导PC12细胞CASP3蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组CASP3蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物组可抑制CASP3蛋白表达(P<0.05)，见图5。

4 讨论

老年性痴呆的发生是一个连续的病理过程，经历轻度认知障碍前期、轻度认知障碍期以及痴呆期。现有关于老年性痴呆的研究多集中在痴呆期，但这一阶段神经元已出现大量死亡，病理进程难以逆转，针对此阶段所开发的药物效果并不理想。将基础和临床研究的窗口前移，采用药食同源的中药材进行早期干预，实现延缓或阻止老年性痴呆的发展进程意义重大。

枸杞子著称补肝益肾的“却老子”，其成分丰富，含多糖类、黄酮类、萜类、甾体化合物、生物碱等活性成分，使其具有丰富的营养和生物活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗氧化、保护中枢神经、抗动脉硬化等作用。本研究发现，枸杞子中隐黄素、新黄质、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质等为枸杞子防治老年性痴呆的主要活性成分。类胡萝卜素作为生命所必须的脂溶性色素，其具有显著的维生素A原活性、抗氧化、抗肿瘤、保肝、神经保护、提高免疫力和抗炎等作用。现代药理研究表明，β-胡萝卜素具有提高SOD和GSH-Px的酶活性[8]，促进PPARG表达的同时抑制CASP3、CASP9、COX2、NF-κB的表达[9-10]，发挥抗炎、抗氧化的作用。叶黄素作为人脑中含量最高的类胡萝卜素，其通过上调PPARγ、RXRα、IGF1、Bcl-2、GSK-3β和p-Akt的表达发挥神经保护作用[11-13]。玉米黄质具有增强抗氧化酶SOD、GSH-Px酶活性的作用[14]，其通过增加Akt表达，降低GSK-3β、Bax和CASP3的水平，激活Akt信号通路抑制氧化应激[15]。枸杞子防治老年性痴呆的活性靶点主要包括11β-羟类固醇脱氢酶1(HSD11B1)、β维甲酸受体(RARB)、糖皮质激素受体(NR3C1)、α维甲酸受体(RARA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)，雌激素受体(ESR1)、胰岛素样生长因子(IGF1)等。HSD11B1作为糖皮质激素的代谢酶，其通过氧化还原将体内无活性的皮质酮转化为有活性的皮质醇，致使局部糖皮质激素水平过高进而损伤海马，影响认知功能[16]。维甲酸类受体属于类固醇和甲状腺激素受体家族，包括RARs和RXRs。RARA和RARB作为转录调节因子，在杏仁核、前额叶皮层和大脑广泛表达，其通过识别靶基因的RARE调控基因转录，参与维持上皮组织的再生，免疫系统的调节，影响突触生长形成。RARB通过HIF1α信号传导系统促进线粒体的增殖和生长锥移动的速度，通过增加细胞内cAMP水平促进神经突起生长[17]。RARA作为海马组织优势核受体，其通过促进胞浆中GluR1翻译诱导海马神经元树突棘的形成[18]。胰岛素样生长因子IGF-1可通过激活PI3K/Akt信号通路和ERK通路，增加Bcl-2的表达，抑制CASP3的活性抑制神经细胞凋亡[19-20]；通过增强L型钙通道电流，使转录因子C/EBP β水平下降，抑制NMDA受体调节的钙内流，促进小脑颗粒神经元存活，发挥神经保护作用[21]。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接相结合的方法探讨药食同源枸杞子防治老年性痴呆的作用机制，构建了枸杞子50个活性成分作用于31个潜在靶点，通过Ras信号，PI3K-Akt信号，神经营养因子信号，多巴胺能神经突触，HIF-1信号等通路调控老年性痴呆的疾病网络。本研究系统揭示了药食同源枸杞子防治老年性痴呆的“活性成分-靶点-通路”的复杂关系，为药食同源中草药枸杞子临床使用提供了理论基础和科学依据。