基于PI3K/Akt通路研究孕育丹糖浆防治大鼠多囊卵巢综合征不孕症的机制

徐云霞， 徐珺萍， 卞景新

(1.安徽中医药大学第一附属医院妇产科，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种发病多因性、临床表现多态性的内分泌疾病，患病率为8%～13%[1]，占无排卵不孕症的80%[2]，具体发病机制尚未明确，其主要特征为高雄激素血症、卵巢多囊样改变、排卵功能异常等，而且疾病呈进行性发展，易致女性生育功能障碍[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是动物体内基础信号通路，通路中许多分子参与调节卵母细胞的生长、原始卵泡的发育、颗粒细胞的增殖和分化等过程[4-6]。

中医古籍中并无“PCOS”这一病名，根据其临床特征将其归属于“不孕”“闭经”“癥瘕”等范畴[7]，其发病多与肾、脾、肝关系密切，单证型以肾虚证为主[8]。孕育丹糖浆是国家名老中医徐志华教授以“肾藏精，主生殖”的中医理论基础为指导，以“温肾暖宫，调补冲任”为治则，结合多年理论研究与临床实践创制的具有自主知识产权的特色医院制剂，主治肾阳虚性不孕症，临床疗效确切[9]。本实验基于PCOS大鼠模型，观察孕育丹糖浆对PI3K/Akt信号通路的调控作用，以期阐明其作用机制。

1 材料

1.1 动物 6周龄SPF级雌性SD大鼠60只，体质量(180±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(皖)2017-001，饲养于安徽中医药大学动物房，饲养环境为室温(22±2)℃，相对湿度 50%～70%，自由摄食饮水，适应性饲养7 d后开始实验。本实验经过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准(审批号2022003)。

1.2 试剂与药物 孕育丹糖浆(皖药制字Z20050059)由熟地黄、盐沙苑子、覆盆子、枸杞子、盐菟丝子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、盐补骨脂、肉苁蓉、锁阳、烫狗脊、当归组成。枸橼酸氯米芬(进口药品注册证号H20140688)购自塞浦路斯高特制药有限公司；来曲唑(国药准字H19991001)购自江苏恒瑞医药股份有限公司。羧甲基纤维素溶液(carboxylmethtl cellulose,CMC,1%，批号130225)购自伊势久(江苏连云港)生物科技有限责任公司；促卵泡素(FSH)定量检测试剂盒(货号RX302805R)、黄体生成素(LH)定量检测试剂盒(货号RX303076R)、雌二醇(E2)定量检测试剂盒(货号RXJ302812R)、睾酮(T)定量检测试剂盒(货号RXJ302700R)均购自泉州市睿信生物科技有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体(货号ZA-09)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(货号ZB-2305)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号ZB-2301)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗Akt多克隆抗体(货号AF6261)、兔抗p-Akt多克隆抗体(货号AF0016)、兔抗PI3K p85 alpha多克隆抗体(货号AF6241)、兔抗VEGF多克隆大鼠抗体(货号AF5131)均购自美国Affinity Biosciences公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(货号RR047A)购自日本TaKaRa公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)试剂盒(货号G3322)购自武汉赛维尔生物科技有限公司公司。

1.3 仪器 RT-6100酶标分析仪、RT-3100全自动洗板机均购自美国Rayto公司；EPS300电泳仪、VE-180电泳槽、VE-186转膜仪均购自上海天能科技有限公司；JW-3021HR高速冷冻离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司；Master-S30 UF纯水机购自上海和泰仪器有限公司；JS-M6P自动曝光仪购自上海培清科技有限公司；PTC-200普通PCR仪购自美国Bio-Rad公司；StepOne Plus荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司；OD1000+超微量分光光度计购自南京五义科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 随机选取10只大鼠为正常组，其余50只大鼠建立PCOS模型。参照文献[10]报道，正常组大鼠灌胃1% CMC，造模大鼠灌胃来曲唑1 mg/kg(溶于1% CMC)，每天1次，连续21 d，最后5天进行阴道涂片，灌胃第21天禁食后眼眶后静脉采血。

2.2 模型验证 造模最后5 d，每天早上在7：00至8：00收集大鼠阴道分泌物制作阴道涂片，瑞氏染色后在显微镜下观察细胞形态及数量比例。图1～2显示，造模大鼠阴道涂片无周期性改变，基本维持在动情间期，显微镜下阴道涂片可见大量点状白细胞及少许片状角质化细胞；血清T水平较正常组升高(P<0.01)，表明造模成功。

2.3 给药方法 造模成功后，造模大鼠随机分为模型组、枸橼酸氯米芬组(0.45 mg/100 g)及孕育丹糖浆低、中、高剂量组(1.0、2.0、4.0 mL/100 g)，每组10只，而正常组、模型组大鼠灌胃给予生理盐水1 mL/100 g，各给药组大鼠灌胃给予相应剂量药物，连续12 d，给药最后5 d内每天进行阴道涂片。给药结束后，进行腹主动脉采血。

2.4 ELISA法检测大鼠血清性激素水平 取材前1 d20：00禁食，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，取腹主动脉血5 mL，4 000 r/min离心20 min，取上层血清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)水平，酶联免疫竞争法检测血清雌二醇(E2)、睾酮(T)水平。

2.5 HE染色观察大鼠卵巢组织病理学改变 取血后处死大鼠，摘取卵巢组织，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制作切片，常规HE染色，在普通光学显微镜下观察卵泡的形态改变并拍照。

2.6 RT-qPCR法检测大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、VEGFmRNA表达 提取大鼠卵巢组织中总RNA，逆转录反应后得到cDNA，采用实时荧光定量PCR技术检测PI3K、Akt、VEGFmRNA表达，2-△△CT法计算各基因的相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法检测大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达 取大鼠卵巢组织适量，加入NP-40细胞裂解液(含PMSF)裂解，12 000 r/min离心15 min，取上清，即得总蛋白，经电泳、转模、孵育一抗二抗、显影后，采用Image J软件测定各蛋白质条带的吸光度值，以目的蛋白与内参蛋白β-actin的吸光度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

2.8 免疫荧光组织化学染色检测卵巢组织中PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表达和定位 取“2.5”项下大鼠卵巢组织切片适量，经常规脱蜡、水化后牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封闭，滴加兔抗VEGF多克隆抗体(1∶100)，在4 ℃下孵育过夜，次日洗涤后滴加FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶400)，室温避光孵育50 min，DAPI复染细胞核，漂洗后甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照，以平均荧光强度为指标进行半定量分析。

3 结果

3.1 阴道涂片检查 给药后，正常组大鼠动情周期基本规律；模型组大鼠动情周期紊乱，基本维持在动情间期，显微镜下阴道涂片可见大量点状白细胞及少许片状角质化细胞；孕育丹糖浆各剂量组和枸橼酸氯米芬组大鼠动情周期大部分恢复规律，并呈周期性变化，动情前期可见有核上皮细胞及少量角化细胞；动情期可见大量外形不规则的角化上皮细胞，有少量有核上皮细胞；动情后期可见不规则角化上皮细胞，有核上皮细和白细胞均可见,且比例相当。见图3。

3.2 孕育丹糖浆对PCOS大鼠血清性激素水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清FSH、LH、T水平升高(P<0.01)，E2水平降低(P<0.01)。与模型组比较，孕育丹糖浆低剂量组FSH、LH、T水平有降低趋势，E2水平有升高趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)；孕育丹糖浆中剂量组FSH、LH、T水平降低(P<0.05，P<0.01)，E2水平升高(P<0.05)；孕育丹糖浆高剂量组及枸橼酸氯米芬组FSH、LH、T水平降低(P<0.01)，E2水平升高(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血清性激素水平

3.3 孕育丹糖浆对PCOS大鼠卵巢组织病理变化的影响 正常组大鼠卵巢组织形态和细胞结构清晰,可见不同发育阶段的卵泡、多个黄体；模型组大鼠卵巢组织可见大小不等的囊腔，卵泡颗粒细胞层数较正常组明显减少，各级卵泡与黄体稀少；与模型组比较，孕育丹糖浆各剂量组大鼠卵巢组织病理变化得到改善，可见各级卵泡及黄体，颗粒细胞层厚度增加且排列整齐，其中高剂量组卵巢改善最明显；枸橼酸氯米芬组大鼠卵巢组织内可见成熟卵泡，体积较大，卵泡液较多，颗粒细胞层厚度增加但排列较紊乱。见图4。

3.4 孕育丹糖浆对PCOS大鼠卵巢组织PI3K、Akt、VEGFmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织PI3K、AktmRNA表达降低(P<0.01)，VEGFmRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，孕育丹糖浆各剂量组和枸橼酸氯米芬组大鼠卵巢组织PI3K、AktmRNA表达升高(P<0.01)，VEGFmRNA表达降低(P<0.01)，见图5。

3.5 孕育丹糖浆对PCOS大鼠卵巢组织PI3K、Akt、p-Akt、VEGF蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达降低(P<0.01)，VEGF蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，孕育丹糖浆各剂量组和枸橼酸氯米芬组大鼠卵巢组织PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，VEGF蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，见图6。

3.6 孕育丹糖浆对PCOS大鼠卵巢细胞中VEGF表达的影响 正常组大鼠卵巢细胞中VEGF表达较少；与正常组比较，模型组大鼠卵巢细胞中VEGF表达增加，呈现明亮的绿色荧光；与模型组比较，孕育丹糖浆各剂量组、枸橼酸氯米芬组大鼠卵巢细胞中VEGF表达有不同程度的降低，绿色荧光减弱，以枸橼酸氯米芬组最明显，见图7。

4 讨论

PCOS以生殖障碍、内分泌异常、代谢紊乱和精神问题为特征,其发病机制尚未阐明[11]。近年来多项研究表明PCOS与PI3K/Akt信号通路密切相关，该通路是调控细胞增殖、抑制细胞凋亡的重要信号通路[12-13]，其与卵巢功能密切相关，尤其影响颗粒细胞的增殖与凋亡、卵母细胞的成熟[14]。颗粒细胞主要为卵母细胞的生长发育提供营养，是卵泡成熟的物质支持细胞[15]。PCOS患者的卵巢病理改变常为颗粒细胞层萎缩变薄，增殖低下[16]。赵帅等[17]认为激活PI3K/Akt信号通路以增强颗粒细胞的增殖能力，降低其凋亡率，有助于改善PCOS排卵障碍。本研究发现，PCOS大鼠卵巢中PI3K/Akt信号通路关键蛋白及基因的表达较正常大鼠降低，且颗粒细胞层菲薄、紊乱；给予孕育丹糖浆治疗后，PI3K/Akt通路相关因子表达升高，颗粒细胞层病理损伤明显修复，说明激活PI3K/Akt信号通路可以上调颗粒细胞的增殖能力，明显改善卵巢病理改变。与孕育丹糖浆比较，氯米芬的作用效果更佳，但氯米芬存在自身局限性，首先，其本质是抗雌激素药物[18]，易致宫颈黏液变稠，子宫内膜容受性差，不利于受精及着床；其次，大约15%～40%女性对氯米芬不敏感，出现氯米芬抵抗[19]。前期研究表明，临床治疗PCOS时联合应用孕育丹糖浆可提高排卵率、妊娠率[20]。

《周易》有云：“天地氤氲，万物化醇，男女媾精，万物化生”，说明受孕关键在于肾中精气充盛。肾阴为卵泡发育成熟的物质基础，肾阳是鼓动卵子排出的动力来源。“氤氲期”即“经间排卵期”，为阴阳二气相接之际，癸水充盛，肾阳充旺，由此可见，肾精充足，阳气旺盛，重阴转阳顺利，乃可排出卵子。徐志华教授认为PCOS主因脏腑功能失调，其中尤以肾虚为关键，治疗时以温补肾阳为主，辅以益阴。孕育丹糖浆由熟地黄、盐沙苑子、覆盆子、枸杞子、盐菟丝子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、盐补骨脂、肉苁蓉、锁阳、烫狗脊、当归组成，共奏温肾助阳、调补冲任之功。方中重用补肾温阳之品，同时选用少量滋养肾阴的药物，温而不燥，阴阳俱顾。孕育丹糖浆通过补益肾中阴阳，使卵泡成熟化生有源，卵子排出得以鼓动，其补阳之力尤甚，保证了氤氲期重阴转阳的顺利运行。

综上所述，孕育丹糖浆防治PCOS的机制可能是通过补益肾中阳气以激活PI3K/Akt信号通路，改善卵巢功能，修复颗粒细胞层损伤，从而提高卵泡质量，增加排卵率，最终达到提高妊娠率的目标。