纳豆发酵对黄芩代谢转化的研究

高腾美， 杨涵月， 常 娟， 常银霞， 魏砚明， 刘必旺

(山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 太原 030619)

黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，主要有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等药理作用[1-2]，其中黄芩苷含量一般不低于9.0%，汉黄芩苷含量为2.0%～8.0%，黄芩素含量为0.10%～1.60%，汉黄芩素含量为0.01%～0.30%[3-4]。黄芩苷、汉黄芩苷分别为黄芩素、汉黄芩素的葡萄糖醛酸化合物，含有糖苷，脂溶性差，转化为黄芩素等苷元在小肠中才能被直接吸收[5]。黄芩素等苷元具有更强的抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等功能活性，生物利用度更高[6-9]。

将黄芩苷转变为黄芩素的方法包括酸碱水解法、酶解法和微生物发酵法[10]，其中微生物转化法具有反应特异性强、条件温和、副产物少、清洁环保等优点[11]。黄酮、生物碱、萜类、皂苷、多酚等中药成分均可采用生物转化[12-15]。姚磊等[16]以牛肉膏为培养基，利用纳豆菌微生物发酵黄芩，但培养过程繁琐，成本高，时间长；本实验采用纳豆发酵黄芩，无须加入牛肉膏等其他培养基，可快速将黄芩苷转化为黄芩素等苷元，具有发酵速度快、转化率高、成本低、实用性强的特点。

1 材料

1.1 仪器 MC-101C纳豆机(中山市名臣电器有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪，配置Waters 2998 PDA 检测器(美国Waters公司)；半微量型号New Classic MS电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；PH-070A干燥箱、HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；LGJ-10型冷冻干燥机(金西盟北京仪器有限公司)；HL-200高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)。

1.2 试剂与药物 黄芩(山西元和堂中药有限公司，产地山西，批号200201)，经山西中医药大学中药与食品工程学院药用植物教研室樊杰副教授鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。纳豆菌菌粉(青岛凯麦森食品科技有限公司)。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为P20A9F39333、C04D8Y49741、R31M9F62605、P11M9F61014)。甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 纳豆制备 选取小粒干黄豆约300 g，加水浸泡8 h后放入高压锅内蒸90 min，冷却至室温，加入1 g纳豆发酵菌粉，搅拌均匀，放入自动纳豆发酵机中发酵，温度约37 ℃，发酵24 h后取出放入保鲜袋内，室温放置30 d以上(发酵时间过短，酶活性、黄芩苷转化率低；发酵30 d以上，黄芩苷转化率趋于稳定)，即得。

2.2 发酵步骤 称取药材粉末适量，高压灭菌后加入2倍量灭菌水、纳豆(研磨成泥状)，在一定温度下发酵，一段时间后在60 ℃下恒温干燥24 h以终止发酵。

2.3 供试品溶液制备 精密称取药材或发酵品0.3 g(扣除纳豆质量)，加70%乙醇40 mL，水浴加热回流3 h，放冷，滤过，少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，滤液置于100 mL量瓶中，70%乙醇定容，精密量取1 mL，甲醇定容至10 mL，即得。

2.4 色谱条件 Thermo BDSHYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%甲酸(C)，梯度洗脱(0～8 min，15%～34%A，5%～6%B；8～25 min，34%～55%A，6%～7.5%B；25～35 min，55%～66%A，7.5%～8%B；35～45 min，66%～80%A，8%～10%B)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长278 nm；进样量20 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验和线性关系考察 取对照品、药材、发酵品溶液适量，在“2.4”项色谱条件下进样测定，色谱图见图1，可知各成分色谱峰达到基线分离。另精密称取上述4种对照品适量，加适量甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为0.60、0.40、0.68、0.50 mg/mL的溶液，稀释成5个质量浓度，在“2.4”项色谱条件下进样测定，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定5次，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.42%、0.54%、0.27%、0.38%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批发酵品，按“2.3”项下方法制备5份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD为0.58%～1.54%，表明该方法重复性好。

2.5.4 稳定性试验 取同一批发酵品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.57%、0.59%、0.62%、0.63%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取同一批发酵品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，稀释成高、中、低质量浓度，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素平均加样回收率为98.15%～101.23%，RSD为0.58%～0.91%。

2.6 单因素试验

2.6.1 粒径 精密称取10、20、40、60目黄芩粉末各15 g，固定黄芩与纳豆比例3∶1，发酵温度37 ℃，按“2.2”项下方法发酵2 d。结果，黄芩苷转化率分别为84.15%、92.45%、96.87%、96.32%，即粒径为40目时最高。

2.6.2 黄芩与纳豆比例 精密称取40目黄芩粉末15 g，固定发酵温度37 ℃，黄芩与纳豆比例分别为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按“2.2”项下方法发酵2 d。结果，黄芩苷转化率分别为93.61%、96.86%、95.27%、94.44%，即黄芩与纳豆比例为3∶1时最高。

2.6.3 发酵温度 精密称取40目黄芩粉末15 g，固定黄芩与纳豆比例3∶1，发酵温度分别为33、35、37、39 ℃，按“2.2”项下方法发酵2 d。结果，黄芩苷转化率分别为68.60%、76.06%、96.87%、85.24%，即发酵温度为37 ℃时最高。

2.6.4 发酵时间 精密称取40目黄芩粉末15 g，固定黄芩与纳豆比例3∶1，发酵温度37 ℃；按“2.2”项下方法分别发酵1、2、3、4 d。结果，黄芩苷转化率分别为91.81%、96.85%、96.87%、96.88%，即发酵时间为4 d时最高，但2 d后变化程度不明显。

2.7 正交试验 在单因素试验基础上，选择粒径(A)、黄芩与纳豆比例(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)作为影响因素，黄芩苷转化率(Y)作为评价指标，每个因素3个水平，见表2。

称取黄芩27份，每组3份，每份15 g，按L9(34)正交表进行试验，结果见表3，方差分析见表4。由表3可知，最优工艺为A2B2C2D2，即粒径40目，黄芩与纳豆比例3∶1，发酵时间2 d，发酵温度37 ℃，黄芩苷转化率为96.87%。由表4可知，各因素影响程度依次为发酵温度>发酵时间>粒径>黄芩与纳豆比例。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

表4 方差分析

2.8 发酵前后成分含量比较 称取黄芩15 g，共3份，按“2.7”项下优化工艺进行发酵，结果见表5～6，可知发酵后黄芩苷、汉黄芩苷含量明显降低，黄芩素、汉黄芩素含量明显升高。

表5 黄芩苷、黄芩素含量测定结果(n=3)

表6 汉黄芩苷、汉黄芩素含量测定结果

3 讨论

在相同发酵条件下，不同发酵时间的纳豆对黄芩苷转化为黄芩素有较大的影响。纳豆发酵时间越长，黄芩苷转化越快，发酵30 d以上后发酵速度趋于稳定。

发酵3 d时，纳豆激酶的活性和含量最高。纳豆在长期发酵过程中会产生纳豆纤溶酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物歧化酶等[17-18]，说明纳豆发酵黄芩转化机理可能与增加的β-葡萄糖苷酶有关，还与纳豆发酵产生的其它多种活性酶有关，纳豆发酵时间长产生酶的种类多是黄芩发酵速度变快的主要原因。

4 结论

本实验采用纳豆发酵黄芩，可缩短黄芩发酵时间，最优发酵工艺为粒径40目，黄芩与纳豆比例3∶1，发酵温度37 ℃，发酵时间2 d，黄芩苷、汉黄芩苷分别转化成其苷元黄芩素、汉黄芩素，转化率分别为96.87%、86.38%。姚磊[16]等报道，优化工艺为发酵时间7 d，黄芩苷平均转化率为96.50%；本实验发酵时间短，黄芩苷转化率相当，不需加入牛肉膏等培养基，成本低，并且纳豆可提供发酵所需的碳源和氮源。