炎宁糖浆与5种临床常用药物对急性肺损伤大鼠的改善作用

魏丹妮， 彭 颖， 马 萍， 李晓波

(上海交通大学药学院，上海 200240)

急性肺损伤是临床常见的由细菌或病毒等感染后所导致的急性炎症性疾病[1]，其病程快、发病急且致死率高，失控的炎症反应是急性肺损伤最重要的发病机制之一[2]。临床败血症并发急性肺损伤患者常经历早期“炎症风暴”状态后逐渐向免疫抑制状态过渡，出现促炎因子和抗炎因子分泌严重受阻及免疫功能障碍，机体最终因无力清除致病菌而死亡[3-5]。急性肺损伤缺乏特效治疗药物，目前大多采用保护性机械通气、ECMO和微循环等支持治疗，抗生素和中成药进行辅助治疗[6-7]，其中抗生素常用于治疗合并肺部和其他器官感染[8-9]，但其作用效能存在较大差异，需依病情选择性治疗[10]；一些清热解毒类中成药具有抗炎、抗氧化、调节机体免疫功能等药理作用[11]，也在多种急性炎症性疾病治疗中具有一定优势[12-13]。

炎宁糖浆由鹿茸草、白花蛇舌草、鸭拓草3味中药组成，具有清热解毒、消炎止痢之功效[14]，临床上广泛用于治疗上呼吸道感染、尿路感染、肠炎等多种疾病。前期小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀实验证实，炎宁糖浆总提取物对急性或炎症早期毛细血管扩张、通透性亢进、渗出、水肿等具有明显的抑制作用[15-16]，但尚无治疗急性肺损伤的报道。本文采用腹腔注射脂多糖诱导急性肺损伤大鼠模型，比较炎宁糖浆、临床常用抗生素(阿莫西林、阿奇霉素和左氧氟沙星)以及常用中成药(蒲地蓝消炎口服液、连花清瘟胶囊)对大鼠的改善作用，以期为急性肺损伤的用药提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量230～290 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(浙)2019-0001，饲养于上海交通大学动物实验中心，自由摄食饮水，12 h照明，温度(25±2) ℃，相对湿度(55±10)%。所有操作均由上海交通大学动物实验中心伦理委员会审查通过后开展(审查编号A2018100)。

1.2 试剂与药物 炎宁糖浆(批号1704003)，购自哈尔滨市康隆药业有限责任公司；阿莫西林(批号1809015)，购自哈药集团制药总厂；阿奇霉素(批号200501)，购自天津市健生制药有限公司；左氧氟沙星(批号BX007A1)，购自第一三共制药(北京)有限公司；蒲地蓝消炎口服液(批号1809613)，购自济川药业集团有限公司；连花清瘟胶囊(批号A1801193)，购自石家庄以岭药业股份有限公司。LPS(批号028M4094V)，购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay试剂盒(批号12005641)，购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；Rat IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α High Sensitivity ELISA Kit(货号70-EK380HS-96、70-EK302HS-96、70-EK304HS-96、70-EK306HS-96、70-EK310HS-96、70-EK317HS-96、70-EK382HS-96)，购自杭州联科生物科技股份有限公司；BCA试剂盒(货号PC0020)，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器 SYSMEX pocH-100iV Diff 全自动动物血液分析仪，购自希森美康医用电子(上海)有限公司；Thermo Multiskan MK3酶标仪，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；电热鼓风干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；BX53M工业正置显微镜，购自奥林斯巴(中国)有限公司；电子天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Bio-Plex MAGPIX System，购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠适应性喂养3 d后随机分为10组，即空白组，模型组，炎宁糖浆低、中、高剂量组，阿莫西林组，阿奇霉素组，左氧氟沙星组，蒲地蓝消炎口服液组，连花清瘟胶囊组，空白组大鼠腹腔注射生理盐水，模型组、给药组大鼠腹腔注射LPS(8 mg/kg)，3 h后给药组大鼠灌胃给予不同药物，连续3 d，模型组和空白组大鼠灌胃等量蒸馏水，具体见表1。

表1 大鼠分组及给药方案

2.2 样本采集 实验期间，观察并记录大鼠造模前后及给药后体质量、毛色、活跃度、饮食饮水量、大便性状、死亡情况等指标，计算死亡率。实验结束后，大鼠腹主动脉取血，取全血1 mL，采用全自动血液分析仪检测血常规指标(血小板、白细胞、淋巴细胞、中间细胞、粒细胞密度)。另取大鼠全血7 mL至促凝管中，在4 ℃下静置过夜，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上层血清分装，在-80 ℃下保存，结扎右肺下叶和支气管进行灌洗，摘取肺和肠组织，在-80 ℃下保存，用于后续研究。

2.3 大鼠肺组织湿干重比检测 取大鼠右肺下叶，滤纸吸干肺表面渗液和血迹，电子天平称定质量，即湿重，再将其置于65 ℃烘箱中72 h至恒重，即干重，计算湿干重比。

2.4 大鼠肺组织病理变化观察 大鼠肺组织置于4%多聚甲醛中固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，在显微镜下观察病理变化。参照美国胸科学会[17]及文献[18-19]报道，对各组大鼠肺损伤程度进行评价，具体见表2。

表2 大鼠肺损伤评分标准

2.5 大鼠肺组织细胞因子检测 大鼠右肺中叶匀浆后，4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液分装，在-80 ℃下保存，按照ELISA检测试剂盒说明书检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

2.6 大鼠血清细胞因子检测 大鼠全血离心取血清，按照Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay试剂盒说明书，通过Luminex液相芯片技术检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

3 结果

3.1 炎宁糖浆与5种常用药物对大鼠体征及死亡率的影响 如图1A所示，LPS诱导后大鼠初期体质量均下降，出现不同程度精神萎靡，弓背、易惊、蜷卧，进食减少，部分出现大便溏泻。给药期间，模型组大鼠仍精神萎靡，眼角和鼻部流出较多血性分泌物，大便干结难解甚至便血，说明LPS诱导后大鼠体征状况不佳并伴有充血性反应。炎宁糖浆中、高剂量组和阿奇霉素组大鼠较模型组活动增多，反应灵敏，行为学状态明显恢复；炎宁糖浆低剂量组、左氧氟沙星组和中成药(蒲地兰口服液、连花清瘟胶囊)组大鼠行为学状态有所好转但不及炎宁糖浆中、高剂量组和阿奇霉素组；阿莫西林组大鼠行为学状态较模型组无明显变化。给药结束后，模型组大鼠体质量低于空白组(P<0.05)；与模型组比较，炎宁糖浆和阿奇霉素均能升高大鼠体质量(P<0.05，P<0.01)，左氧氟沙星组和中成药组大鼠体质量有所回升，阿莫西林组大鼠体质量降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

经LPS造模后，模型组大鼠死亡率达42.9%；连花清瘟胶囊组和炎宁糖浆中、低剂量组大鼠死亡率较低，分别为16.7%、25.0%、33.3%，见图1B。由此提示，炎宁糖浆和阿奇霉素对大鼠体质量和行为学恢复具有较好的改善作用，连花清瘟胶囊和炎宁糖浆中、低剂量均可一定程度缓解LPS对大鼠造成的毒性，分别降低了61.07%、41.72%、22.38%。

3.2 炎宁糖浆与5种常用药物对大鼠血常规指标的影响 如表3所示，与空白组比较，模型组大鼠全血中白细胞、淋巴细胞、中间细胞和粒细胞密度均升高(P<0.05)，血小板密度降低了约82.57%(P<0.01)，表明大鼠机体出现严重炎症反应，而且免疫功能出现紊乱。与模型组比较，炎宁糖浆组和阿奇霉素组大鼠血小板密度均呈升高趋势，其中炎宁糖浆高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，阿奇霉素组大鼠全血中间细胞、粒细胞密度分别降低了60.00%、87.41%(P<0.05)，连花清瘟胶囊组大鼠全血中间细胞密度降低了52.00%(P<0.05)。炎宁糖浆与5种常用药物对白细胞、淋巴细胞无明显调节作用(P>0.05)，阿莫西林、左氧氟沙星和蒲地蓝消炎口服液对大鼠5项血常规指标无明显调节作用(P>0.05)。以上结果表明，炎宁糖浆高剂量、阿奇霉素、连花清瘟胶囊对大鼠部分异常血常规指标具有一定改善作用。

3.3 炎宁糖浆与5种常用药物对大鼠肺水肿的改善作用 如表4所示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织湿干重比升高了5.38%(P<0.05)，说明大鼠肺水肿严重；与模型组比较，炎宁糖浆中剂量组大鼠肺组织湿干重比降低了4.32%(P<0.05)，其余各给药组大鼠肺组织湿干重比有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。其中，阿莫西林组大鼠肺湿重低于模型组(P<0.05)，可能与阿莫西林组大鼠体质量减轻有关。以上结果表明，炎宁糖浆中剂量在改善大鼠肺水肿方面可能优于其他抗生素及中成药。

表3 各组大鼠血常规指标

表4 各组大鼠肺组织湿干重比

3.4 炎宁糖浆与5种常用药物对大鼠肺组织病理变化的影响 如图2所示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织结构被破坏，肺泡腔和肺组织间质内伴有大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔偶见透明膜形成，亦可见蛋白质残留物，且模型组大鼠肺损伤评分升高(P<0.01)，表明大鼠肺部病理损伤严重。与模型组比较，炎宁糖浆中、高剂量组、阿奇霉素组和蒲地兰消炎口服液组大鼠肺泡壁变薄，肺泡壁和肺泡腔内炎症细胞数量及肺泡腔内透明膜和蛋白质碎片减少，肺损伤评分降低(P<0.05，P<0.01)；炎宁糖浆低剂量组、阿莫西林组、左氧氟沙星组和连花清瘟胶囊组大鼠恢复程度不如其他给药组，肺泡腔和肺组织间质内有较多炎症细胞浸润，肺损伤评分无明显变化(P>0.05)。以上结果表明，中、高剂量炎宁糖浆、阿奇霉素及蒲地兰消炎口服液对大鼠肺组织形态异常的改善作用可能较其他给药组更为明显。

3.5 炎宁糖浆与5种常用药物对大鼠血清、肺组织细胞因子的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清Th1型(IFN-γ)、Th2型(IL-2、IL-4)、Th17型(IL-17A)、Treg型(IL-10)、IL-6水平均降低(P<0.01)，而模型组大鼠肺组织上述7种细胞因子水平均无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，炎宁糖浆能上调血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，阿奇霉素能上调血清IL-4、IL-10水平(P<0.05)，左氧氟沙星能上调血清IL-17A水平(P<0.05)，蒲地蓝消炎口服液能上调血清IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，见图3。与模型组比较，炎宁糖浆能下调肺组织IL-6水平(P<0.05)，阿奇霉素能上调肺组织IL-17A水平(P<0.05)，蒲地兰消炎口服液能下调肺组织IL-2、IL-6水平(P<0.05，P<0.01)，连花清瘟胶囊能下调肺组织IL-6、IL-10水平(P<0.01)，而阿莫西林对大鼠血清和肺组织上述7种细胞因水平子均无显著调节作用(P>0.05)，见图4。上述结果提示，炎宁糖浆、蒲地兰口服液均能较好地改善大鼠血清中免疫抑制状况，促进血液中受阻的Th1型、Th2型和Th17型细胞因子分泌，从而一定程度上恢复机体免疫平衡。

4 讨论

研究发现，免疫抑制及严重免疫功能障碍常发生于临床败血症并发急性肺损伤患者后期，患者脾脏细胞出现促炎因子和抗炎因子分泌大量减少，严重威胁患者生存[3-5]。本研究结果显示，LPS诱导后模型组大鼠血清中多种促炎因子和抗炎因子分泌严重受阻，表明机体发生免疫功能障碍且处于全身性免疫抑制及继发性低炎状态中。与血清细胞因子不同，模型组大鼠肺组织多种细胞因子与空白组比无明显差异，推测可能作为急性肺损伤最早受累且损伤最严重的器官[20]，肺脏仍处于“高炎”向“低炎”过渡阶段，较急性肺损伤机体血液系统恢复更缓慢。

中药对大鼠改善作用研究多采用预防给药模式[21-23]，与临床差异较大。本研究采用腹腔注射LPS大鼠模型，模拟临床多发的由肺外因素导致急性肺损伤的发病特征，同时结合“先病后治”特点，在造模后给予不同药物。结果发现，中、高剂量炎宁糖浆可减轻肺组织病理损伤，在减轻急性肺损伤大鼠肺水肿和改善血小板减少方面作用较突出，但在改善白细胞水平方面不及阿奇霉素和连花清瘟胶囊。炎宁糖浆能有效逆转多种炎症因子如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A等异常分泌，以高剂量作用最显著。研究发现IFN-γ、IL-2主要由Th1细胞分泌，可诱导巨噬细胞活化，发挥对抗胞外病原菌作用，介导细胞免疫应答[24-25]。IL-4主要由Th2细胞分泌，能促进抗体生成并介导体液免疫。IL-17A是Th17细胞特异性分泌的细胞因子，不仅可诱导中性粒细胞在炎症部位聚集，还能延迟活化的中性粒细胞在炎症部位凋亡，但也可能导致组织损伤[26-27]。因此推测炎宁糖浆可能通过促进急性肺损伤大鼠免疫抑制状态下Th型和Treg型细胞因子分泌以促进机体免疫功能恢复。本研究发现，阿奇霉素(大环内酯类抗生素)对大鼠的改善作用较其他2种抗生素更突出，主要体现在改善急性肺损伤大鼠肺组织结构，逆转大鼠血液中白细胞及炎症因子水平的异常变化等。连花清瘟胶囊、蒲地兰消炎口服液和左氧氟沙星(喹诺酮类抗生素)对大鼠部分异常指标具有一定调控作用。此外，连花清瘟胶囊在降低动物致死率方面作用突出，但在其他药效指标上不及炎宁糖浆和阿奇霉素，其作用机理有待进一步研究。阿莫西林(β-内酰胺类抗生素)对LPS诱导后大鼠各项指标无明显调控作用。不同药物调控急性肺损伤大鼠血清与肺组织细胞因子的种类和程度存在差异，可能与药物特性有关。而3种中成药虽对血清中IL-6无显著调控作用，但均能降低肺组织IL-6水平，可能通过中药的多成分、多靶点、多途径调控肺脏，从而加快靶器官渡过“高炎期→低炎期”的机体修复进程。

综上所述，抗生素阿奇霉素较阿莫西林和左氧氟沙星更有效减轻LPS诱导后大鼠症状；中成药(炎宁糖浆、蒲地兰消炎口服液和连花清瘟胶囊)对大鼠均具有一定改善作用但特点不同，其中，炎宁糖浆在改善急性肺损伤大鼠肺水肿、血小板减少、多种炎症因子分泌失调等方面发挥了较好作用。