芹菜素纳米结构脂质载体的制备及其体内抗肿瘤活性研究

王风云， 李伟宏

(河南应用技术职业学院，河南 郑州 450042)

芹菜素属于黄酮类化合物，也称芹黄素，主要存在于柏科圆柏叶、卷柏科卷柏全草及伞形科植物旱芹叶中[1]，具有多种活性，主要包括抗炎、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓、抗病毒、抗焦虑等[2]，并且近年来其抗肿瘤作用也日益得到关注[3-5]，尤其是在抗乳腺癌方面最显著，其机制可能是通过增加Bax/Bcl-2比值、下调突变型p53基因表达、上调P73介导PIG3基因表达等来抑制肿瘤细胞生长[5]，但该成分为难溶性物质[6]，难以制成注射剂。纳米技术是难溶性药物制成注射剂的有效途径[7]，往往可增强中药有效成分的抗肿瘤活性，已报道的芹菜素相关研究有固体脂质纳米粒[1]、PLGA纳米粒[8]、胶束[9]等，但存在包封率和载药量不高、稳定性差等缺陷。

纳米结构脂质载体将固液脂质联合使用，具有较高的包封率及载药量[10-13]，稳定性良好，能有效改善难溶性药物的溶解性、药效等[14-15]。本实验制备芹菜素纳米结构脂质载体，并考察其体内抗肿瘤活性，以期为该成分提供可静脉注射的剂型，丰富其抗肿瘤活性研究，也为相关临床应用奠定基础。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(配置二极管阵列检测器，美国Agilent公司)；MSA6.6S型电子分析天平(百万分之一，上海精密仪器仪表有限公司)；TMX-22R型高速离心机(美国贝克曼-库尔特公司)；PRD-S-027HDHT型超声波清洗仪(深圳市普瑞登科技有限公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；ELx808型酶标仪(山东浩中化工科技有限公司)；HSX-1000N恒温恒湿培养箱(上海幕斯实验设备有限公司)；超滤离心管(30 kDa，美国Millipore公司)。

紫杉醇注射液(批号200518，北京协和药厂)。芹菜素原料药(批号200218，纯度98.6%，陕西惠科植物开发有限公司)。Miglyol®812(批号P20191205，北京凤礼精求医药股份有限公司)；单硬脂酸甘油酯(批号161025，北京凤礼精求医药股份有限公司)；泊洛沙姆188(批号20201105，武汉新大地环保材料股份有限公司)。

人乳腺癌MDA-MB-231细胞，购自河南省肿瘤研究所。

SPF级雌性裸鼠，6～7周龄，体质量20～24 g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定芹菜素含量

2.1.1 色谱条件 Agilent SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸-乙腈(30∶70，超声混匀后单泵进样)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长312 nm。

2.1.2 线性关系考察 称取芹菜素对照品50 mg至50 mL量瓶中，30 mL甲醇超声处理3 min，静置10 min后甲醇定容，得1.0 mg/mL贮备液，流动相依次稀释成50.0、25.0、10.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=18.712 5X+0.843 2(r=0.999 9)，在0.05～5.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超声处理3 min，流动相定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察 取纳米结构脂质载体混悬液适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得芹菜素含量RSD为1.32%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得芹菜素含量RSD为0.71%，表明仪器精密度良好。取同一份供试品溶液，于0、1、2、4、8、12 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得芹菜素含量RSD为0.85%，表明溶液在12 h内稳定性良好。取9份纳米结构脂质载体混悬液，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分为低、中、高3组，每组3份，分别加入对照品溶液0.6、0.8、1.0 mL，30 mL甲醇超声处理3 min，流动相定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得芹菜素平均加样回收率分别为99.37%、100.13%、99.69%，RSD分别为0.44%、0.72%、0.50%。

2.2 纳米结构脂质载体制备 固定芹菜素用量为50 mg，固态脂质材料为单硬脂酸甘油酯，液态脂质材料为Miglyol®812，加入20 mL无水乙醇，75 ℃水浴搅拌溶解，作为有机相；固定水相体积为60 mL，加入一定量泊洛沙姆188，75 ℃水浴搅拌溶解，作为水相，在800 r/min下将有机相滴至水相中，滴毕后敞口搅拌1.5 h，在300 W功率下超声处理15 min(工作2 s，间隔2 s)，置于-15 ℃冰箱中低温固化10 min，室温静置20 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，补加蒸馏水至60 mL，摇匀，即得。

2.3 包封率、载药量测定 取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超声处理3 min，流动相定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算芹菜素总含量(m总)。取1 mL纳米结构脂质载体混悬液至超滤管中，12 000 r/min离心30 min，取外管续滤液，计算游离芹菜素含量(m游离)，按照文献[12]报道的方法测定包封率、载药量。

2.4 粒径、Zeta电位测定 取0.1 mL纳米结构脂质载体混悬液，加入3.5 mL蒸馏水混匀，转移至比色皿中，测定粒径、Zeta电位。

2.5 Box-Behnken响应面法 对纳米结构脂质体而言，包封率、粒径是重要指标[9]。课题组前期考察大豆油、Miglyol®812、油酸，发现以Miglyol®812制备时包封率、粒径均优于大豆油、油酸，故选择其作为液态脂质。不同固液脂质比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)对包封率有一定影响，而对粒径影响更大，由于1∶1时初乳有分层现象，5∶1时包封率较低，故对2∶1、3∶1、4∶1进行优化。不同脂药比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)对包封率、粒径有一定影响，由于25∶1时包封率不再增加，粒径开始增大，故对10∶1、15∶1、20∶1进行优化。不同表面活性剂用量(0.5%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)对包封率、粒径的影响较大，由于0.5%时粒径较大，包封率较低，1.8%时包封率出现下降趋势，故对0.8%、1.2%、1.6%进行优化。再对超声功率(200、250、300、350 W)、超声时间(5、10、15、20 min)进行考察，最终确定两者分别为300 W、15 min。

在上述预实验基础上，选择脂药比(X1)、固液脂质比(X2)、表面活性剂用量(X3)作为影响因素，包封率(Y1)、粒径(Y2)作为评价指标，采用Box-Behnken响应面法优化制备工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 Y1方差分析

表4 Y2方差分析

响应面分析见图1～2。由图1可知，固定X3时随着X1或X2增加，包封率先升后降，以X1影响程度更明显；固定X1时X2与X3交互作用较明显，包封率随着X2或X3增加有降低趋势；固定X2时包封率随着X1增加先升后降。由图2可知，X1X2、X1X3、X2X3曲面均较陡峭，表明两者交互作用明显，随着其中2个因素同时减小，粒径均呈先降低后略微升高的趋势。最终确定，最优工艺为脂药比14.3∶1，固液脂质比3.8∶1，表面活性剂用量1.3%，包封率为84.54%，粒径为162.4 nm。按上述优化工艺平行制备3份纳米结构脂质载体，测得平均包封率为82.87%，粒径(图3)为164.8 nm，与预测值84.54%、162.4 nm接近，表明该工艺稳定可行。

2.6 载药量、Zeta电位测定及形态观察 取“2.5.4”项下3批纳米结构脂质载体，按“2.3”项下方法测得平均载药量为5.13%，按“2.4”项下方法测得平均Zeta电位(图4)为-33.5 mV。

取纳米结构脂质载体混悬液0.1 mL，加入3 mL蒸馏水混匀，滴在铜网上，静置0.5 h后滴加0.5%钨酸钠溶液，静置10 min染色，滤纸轻轻吸去多余液体，在透射电镜(TEM)下观察，结果见图5。由此可知，纳米结构脂质载体呈球形或椭圆形，基本无粘连。

2.7 体外释药研究 设定溶出仪温度为(37±1)℃，搅拌桨转速为75 r/min，释放介质为2%SDS溶液，体积为1 000 mL。剪取5 cm透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)，活化后备用。取纳米结构脂质载体混悬液(芹菜素含量为2 mg)适量，加入3 mL释放介质，转移至透析袋，两端扎紧，再制备芹菜素乙醇溶液及2%SDS混悬液，同法操作，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h各取样3 mL，同时补加3 mL空白释放介质，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测定累积释放度，结果见图6。由此可知，乙醇溶液在6 h内基本释放完全，透析袋基本不吸附该成分；2%SDS混悬液12 h内累积释放度为35.17%，但72 h内仅增加至38.63%；纳米结构脂质载体在前6 h释药相对较快，累积释放度为51.32%，之后进入明显的缓慢释药阶段，72 h内累积释放度为79.08%。

2.8 介质稳定性研究 取纳米结构脂质载体混悬液适量，分别与1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液等体积混合，或与空白血浆按1∶4比例混合，置于37 ℃水浴中，于0、4、8、12、16、20、24 h测定粒径，结果见图7。由此可知，加入1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液或空白血浆后粒径均有增加趋势，但在1.8%NaCl溶液中程度最小，故选择其作为注射介质。

2.9 体内抗肿瘤活性研究

2.9.1 模型建立 取对数生长期的MDA-MB-231细胞，生理盐水重悬其密度至2.5×107/mL，接种前将细胞悬液摇匀以保证肿瘤呈圆形或类圆形。将细胞悬液振荡后，于超净工作台上按0.2 mL/只剂量接种于裸鼠背部右侧靠近腋窝处皮下，轻压注射点以防止细胞外渗，全程在SPF级实验环境中进行。

2.9.2 分组、给药与指标检测 将荷瘤裸鼠随机分为空白组、阳性组(5 mg/kg紫杉醇)及芹菜素纳米结构脂质载体低剂量组(2 mg/kg)、中剂量组(5 mg/kg)、高剂量组(10 mg/kg)，每组8只，每2 d天腹腔注射给药1次，连续3周。每3 d测量肿瘤短径(a)、长径(b)，计算瘤体积V[16]，公式为V=ab2π/6，选择大于100 mm3者进行后续研究。实验结束后称定瘤重，颈椎脱臼处死裸鼠，剥离瘤体，计算抑瘤率，公式为抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/空白组平均瘤重)×100%[16-17]。

2.9.3 结果分析 各组裸鼠均未出现死亡现象，并且体质量变化程度均未超过15%(增重分别为13.7%、9.6%、3.2%、-4.7%、-12.9%)，一般认为在治疗期间动物死亡超过20%或体质量下降超过15%时均为药物毒性反应[18]，可知本实验所用药物剂量基本不产生毒性。图8～9、表5显示，各组裸鼠瘤体积由大到小依次为空白组、芹菜素纳米结构脂质载体低剂量组、芹菜素纳米结构脂质载体中剂量组、芹菜素纳米结构脂质载体高剂量组、阳性组；与空白组比较，阳性组及芹菜素纳米结构脂质载体中、高剂量组裸鼠瘤重降低(P<0.01)，表明抑瘤作用显著，其中高剂量组降低程度与阳性组无明显差异(P>0.05)，抑瘤率大于30%，具有较好的开发潜力，并且2组裸鼠体质量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明高剂量芹菜素纳米结构脂质载体毒性可能低于紫杉醇。

3 讨论

芹菜素在水中溶解度仅为1.35 μg/mL[6]，不具备直接制成注射剂的条件[16]，故本实验采用纳米技术将该成分制成纳米结构脂质载体，并采用Box-Behnken响应面法优化处方。体外释药研究结果显示，初期(0～6 h)释药较快，可能是由于纳米结构脂质载体中存在一定量的游离芹菜素，也可能与吸附在纳米结构脂质载体浅表层、表层的药物容易释放有关；后期(6 h后)释药较慢，可能是由于固液脂质载体对包裹于内部的药物有阻滞作用所致[15]。

表5 各组裸鼠抑瘤率比较

正常组织细胞间距一般在50 nm左右，而肿瘤细胞由于生长速度较快，导致其细胞间距也较大，一般在100～250 nm之间[17]，故200 nm左右粒径的纳米制剂可选择性进入肿瘤组织而发挥抗肿瘤作用，提高药效，同时其缓释作用也有助于药物持续发挥药效[7,19]。芹菜素体内稳定性存在一定问题[20]，而采用固体脂质体包裹后有助于改善其稳定性，提高药效。体内抗肿瘤研究结果表明，纳米结构脂质载体高剂量组(10 mg/kg)的肿瘤抑制率超过30%，基本达到紫杉醇(5 mg/kg)水平。本实验解决了芹菜素制备注射剂的难题，而且证明了其体内有效性，后续将对该成分体内药动学、冻干制剂工艺、质量标准等方面作进一步研究。