根系分泌物在‘热研2号’柱花草与鬼针草生长早期种间干扰中的作用

王俐媛，王 坚，李雪枫*, 赵元辰，许 超

(1.热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室/海南大学林学院，海南 海口 570228；2.海南大学动物科技学院，海南 海口 570228)

柱花草(Stylosanthesspp.)又名笔花豆、巴西苜蓿，原产中南美洲及加勒比海地区[1]。柱花草作为放牧刈割兼用的优质牧草，选育出的多个品种现已在世界热带和亚热带地区推广利用[2-3]。其中，‘热研2号’柱花草(S.guianensisSw.‘Reyan No.2’)在海南、广东、广西、台湾、福建、云南、四川等地区均可种植，是最适合我国热带、南亚热带种植的豆科牧草之一，适用于改良天然草地、刈割利用或晒制干草粉，供作猪、禽的配合饲料，现成为柱花草的当家品种[3-4]。为建立高产刈割草地，‘热研2号’柱花草通常采用种子繁殖，播种期2～5月，种子田播种量为6.0～7.5 kg·hm-2，条播，行距40～50 cm[5]。柱花草在幼苗期生长缓慢，且条播时预留的生长空间较大，而此时杂草却因为水热条件适宜而生长迅速，与柱花草幼苗争肥、争水、争光，侵占幼苗生长空间，危害柱花草幼苗，若管理不当，可能会导致柱花草草产量显著降低[6]。

菊科(Asteraceae)一年生杂草鬼针草(BidenspilosaL.)因具有灵活的交配特性，既可以异交授粉，又能自交结实，结实率高，单个花序的结实率就高达77.54%[7-8]，种子上的芒刺利于其附着其它物体广泛传播，萌发率也高达80%以上[7]，还能够通过较强的化感作用增强其入侵为害能力[9]，是海南省旱生环境发生的优势杂草之一[10]，不但在海南各地的农业生态系统中随处可见，也是柱花草草地入侵为害的代表性杂草之一。目前，学者们已经研究了用南方菟丝子寄生[11]、水稻秸秆-薄膜连续叠加覆盖[12]等农业生态方法和喷施广谱性或灭生性除草剂的化学方法[8]来有效控制鬼针草的蔓延，但这些防控方法难以直接用于柱花草草地中鬼针草的防控，易危害柱花草的生长。因此，需要摸清柱花草与鬼针草的种间相互作用机制，为探索柱花草草地新的、安全高效的鬼针草防控方法提供理论依据。

植物种间相互作用包括竞争作用和化感作用[13]，而根系分泌物在植物与植物根系相互作用中发挥着关键作用[14-15]。邻近生长的植物彼此的根系均会不断地向根际环境释放出多种化合物，包括氨基酸、糖类、有机酸、维生素、核苷酸以及各种其他次级代谢物和粘液、蛋白质等许多其他高分子量物质[14,16]。这些根系分泌物既可以改变土壤的化学和物理性质、调节土壤微生物群落结构[17]，也可以作为信号物质促使植物进行相应生长调节响应[18]。已有的研究表明：在植株体无任何接触情况下，柱花草根系分泌物对鬼针草幼苗的生长有相对较弱的抑制效应[19]，而鬼针草的根系分泌物在决定鬼针草与其他植物的相关关系中也起着重要的作用[8,20]，但鬼针草根系分泌物对柱花草的化感效应尚未见报道，柱花草与鬼针草的种间相互作用情况也尚不明确。因此，本研究首先采用水培法来估测无任何株体接触条件下，柱花草和鬼针草各自的根系分泌物对彼此幼苗生长的化感效应差异，然后用盆栽法分析二者在不同的伴生条件下，根系接触和根系分泌物交流程度对柱花草与鬼针草的种间干扰的影响情况，以期揭示根系分泌物在二者种间关系中的作用，为人工草地开发科学合理的杂草农业生态管理策略提供理论参考，为鬼针草入侵生境的生态修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘热研2号’柱花草的种子由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家热带牧草中期备份库提供。鬼针草种子采集自海南大学海甸校区及其周边地区的鬼针草成熟个体，自然风干后，保存于阴凉干燥处备用。

营养液购自福州飞净生物科技有限公司，霍格兰营养液成分为：硝酸钾607.00 mg·L-1，磷酸二氢钠115.00 mg·L-1，硫酸镁493.00 mg·L-1，EDTA铁钠盐20.00 mg·L-1，硫酸亚铁2.86 mg·L-1，硼砂4.50 mg·L-1，硫酸锰2.13 mg·L-1，硫酸铜0.05 mg·L-1，硫酸锌0.22 mg·L-1，硫酸铵0.02 mg·L-1。取本品0.63 g，另取钙盐0.47 g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，配制成1/2霍格兰营养液备用。

盆栽试验所用土壤按V(砖红壤)∶V(营养土)=1∶1配制。砖红壤采自海南大学儋州校区试验基地，土壤理化性质为有机质15.84 g·kg-1，碱解氮124.46 mg·kg-1，速效钾59.93 mg·kg-1，有效磷87.65 mg·kg-1，盐基饱和度17.82%，pH=5.90。营养土购自内蒙古巴彦淖尔市跃羊生物科技有限责任公司海南东方市代理销售处，原料选自内蒙古天然草原羊粪，有机质含量≥45%，氮、磷、钾含量≥5%。

1.2 试验方法

1.2.1种子催芽处理 柱花草的种子用75%的酒精表面消毒5 min，冲洗干净后用80℃水浴处理3～5 min，自然晾干[21]，置于铺有双层滤纸、直径9 cm的培养皿中催芽；鬼针草种子消毒处理、晾干后，直接选取均一饱满的种子置于同样规格的培养皿中。所有培养皿均上盖置于25℃黑暗条件下培养至种子萌发，中途每天开盖添加1 mL去离子水。

1.2.2水培生长试验 参考魏嘉禾和陈斌[22]的研究方法，采用营养液水培法分别收集柱花草和鬼针草的根系分泌物。挑选催芽处理后同期露白的柱花草和鬼针草的种子(胚根突破种皮0.5～1 cm)分别移植至盛有1/2 Hoagland营养液(pH=5.80)、液面覆双层脱脂纱布的15 mL玻璃管，每管1株植株；玻璃管放入上盖有20个孔洞的培养箱中，每孔1个玻璃管，使浸入营养液的根系避光生长。培养箱置于25℃/14 h黑暗、30℃/10 h光照、相对湿度75%的人工气候箱内培养。每天定时向玻璃管内补充营养液，使液面保持在恒定水平。共培养10 d，使每个玻璃管内的液体中均含有所生长植株分泌的根系分泌物。

待各植株幼苗在1/2 Hoagland’s营养液中生长10 d后，选取长势一致的柱花草和鬼针草植株，将鬼针草幼苗与柱花草的幼苗对调后继续培养，即鬼针草幼苗置换至原本生长柱花草的玻璃管、而柱花草幼苗置换至鬼针草幼苗原本生长的玻璃管，每株对应一个试管；以柱花草幼苗和鬼针草幼苗分别移植到原本生长同种植物的玻璃管中继续培养为对照。每个处理设4个重复。生长7天后，测量每株幼苗的苗高、根长，计数其侧根数，然后用吸水纸吸干各植株表面的水分，用感量0.1 mg天平测定其芽鲜重和根鲜重。

1.2.3盆栽生长试验 参考汪雪等[23]的试验方法，将催芽处理后的柱花草幼苗与鬼针草幼苗等距离相邻盆栽伴生，地上部枝条间可自然接触，地上部根系间设置3种接触方式，使植株间的生长受不同程度的彼此间根系分泌物的影响。分别为：①根系自由接触，花盆内无分隔物，两种植物根系分泌物可自由交换；②根系不完全接触，花盆内用30 μm尼龙网袋分隔，两种植物根系间不能直接接触，但根系分泌物可以进行交换；③根系无接触，花盆内用塑料袋分隔，两种植物根系完全不接触，根系分泌物不能相互交换。以3种根系接触方式下内外圈均种植同一种植物为对照。在花盆左右两侧分别穴播2～3粒催芽露白的柱花草和鬼针草种子，出苗生长至2～3叶间苗，每穴保留1株幼苗，每盆柱花草和鬼针草的株数比为1∶1。第30 d，计数每株植物分枝数，测量株高后，小心用蒸馏水清洗并分开2种植物的根系，用根系扫描仪测量测总根长、根体积和侧根数；再将每株植物根、茎、叶分开，分别置于105℃鼓风干燥箱杀青30 min后70℃烘干至恒重，称取各部分干重。

1.3 数据处理与分析

水培生长试验中，为便于分析柱花草与鬼针草的生长情况，各指标采用相对值(相对指标值(%)=处理指标/对照指标)表示，并利用化感效应指数(Allelopathic response index,RI)、化感综合效应指数(Synthetical effect of allelopathy,SE)[24]分析柱花草与鬼针草根系分泌物对彼此幼苗生长的化感作用；伴生生长试验中，采用相对产量(Relative yield,RY)、相对产量总和(Relative yield total,RYT)以及竞争平衡指数(Competitive balance index,CB)[4]分析柱花草和鬼针草在混种后的竞争情况。计算公式如下：

化感效应指数(RI)=

1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T≥C)

(1)

化感综合效应指数(SE)=

(RIH+RIR+RIL+RIRW+RIHW+RITW)/6

(2)

式中T为处理值，CK为对照值，RI>0表示存在促进作用，RI<0表示存在抑制作用。RIH，RIR，RIL，RIRW，RIHW，RITW分别为同一处理下的苗高、根长、侧根数、根鲜重、苗鲜重、总鲜重的化感效应指数。SE>0表示化感综合效应为促进，SE<0表示化感综合效应为抑制，SE的绝对值越大表示化感综合效应越强。

柱花草相对产量(RYS)=YSB/YS

鬼针草相对产量(RYB)=YBS/YB

(3)

式中YSB为柱花草与鬼针草混种时柱花草的单株产量，YBS为柱花草与鬼针草混种时鬼针草的单株产量，YS，YB分别为柱花草、鬼针草在单种时的单株产量，RY<1，说明植株种内竞争小于种间竞争，RY=1，说明种内竞争等于种间竞争，RY>1，说明种内竞争大于种间竞争。

相对产量总和(RYT)=(RYS+RYB)/2

(4)

其中：RYT<1，说明柱花草与鬼针草间具有竞争作用，RYT=1，说明柱花草与鬼针草需要相同资源，可以通过竞争将一种排除出去，RYT>1，说明柱花草与鬼针草间无竞争作用。

竞争平衡指数(CB)=ln(RYS/RYB)

(5)

其中：CB<0，说明柱花草的竞争能力比鬼针草弱，CB=0，说明柱花草与鬼针草的竞争能力相等，CB>0，说明柱花草的竞争能力比鬼针草强，CB值越大，竞争能力越强。

采用SPSS 21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)对数据进行统计分析。柱花草和鬼针草幼苗在彼此根系分泌物处理下的各生长指标与对照(自身根系分泌物处理)间的差异均采用独立样本T检验(Independent-Samples T，Test)进行显著性分析(P=0.05)。3种根系接触方式下柱花草和鬼针草各生长指标、竞争指标间的差异均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan法多重比较(P=0.05)。所有数值均表示为“平均值±标准差”。用GraphPad Prism 8(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行作图。

2 结果与分析

2.1 水培条件下柱花草和鬼针草的根系分泌物对彼此幼苗生长的影响

鬼针草根系分泌物处理下，柱花草幼苗的根长、侧根数均比在自我根系分泌物处理中增加(表1)，其中，柱花草幼苗的根长增加了23.82%(P<0.05)，侧根数增加了166.67%(P<0.05)；柱花草根系分泌物处理下，鬼针草幼苗的苗高、根长比在自我根系分泌物处理中降低，其中根长降低了28.14%(P<0.05)，而鬼针草幼苗的侧根数比在自我根系分泌物处理中增加。两两比较显示，在彼此根系分泌物影响下，柱花草的根长、侧根数均显著高于鬼针草(P<0.05，表1)。鬼针草根系分泌物处理下，柱花草幼苗的根鲜重、苗鲜重、总鲜重均降低，根冠比增加，但与自我根系分泌物处理均无显著差异；柱花草根系分泌物处理下，鬼针草幼苗的根鲜重和根冠比分别比自我根系分泌物处理增加了24.36%，65.71%(P<0.05)，而鬼针草幼苗的苗鲜重、总鲜重均受到抑制，但差异不显著。两两比较显示，彼此根系分泌物影响下，各生物量指标(根鲜重、苗鲜重、总鲜重)在柱花草与鬼针草间均无显著差异(表1)。

鬼针草根系分泌物对柱花草的苗高、根鲜重、苗鲜重和总鲜重均有化感抑制效应，而根长和侧根数表现出化感促进作用，且鬼针草根系分泌物对柱花草的化感综合效应为促进；柱花草根系分泌物影响下，除侧根数和根鲜重外，鬼针草的各生长指标均表现为化感抑制效应，其化感综合效应指数值为-0.08(表1)。

表1 对方根系分泌物影响下柱花草和鬼针草幼苗生长的变化

2.2 土培条件下根系分泌物对柱花草和鬼针草相互作用的影响

2.2.1不同根系接触方式下柱花草与鬼针草伸长生长差异 与根系自由接触相比，根系不完全接触和无接触方式下柱花草和鬼针草的根长显著增加(P<0.05)，且根系无接触时的根长均最大，分别为14.29 cm，28.51 cm(图1A)。柱花草在根系无接触下的苗高比自由接触和不完全接触显著增加(P<0.05)，而鬼针草的苗高在3种接触方式间无显著差异(图1B)。柱花草和鬼针草的根体积均在不完全接触下达到最大值，分别比自由接触和无接触增加了190.00%，117.50%和271.43%，85.71%(P<0.05，图1C)。与根系自由接触相比，不完全接触和无接触方式下柱花草和鬼针草的分枝数均增加，且在根系无接触下柱花草的分枝数增加了59.26%(P<0.05)，在不完全接触和无接触下鬼针草的分枝数增加了193.33%，186.67%(P<0.05，图1D)。

图1 不同根系接触方式下柱花草和鬼针草的根长(A)、苗高(B)、根体积(C)和分枝数(D)的变化

2.2.2不同根系接触方式下柱花草与鬼针草生物量积累与分配的差异 与根系自由接触相比，柱花草的根生物量、茎生物量、叶生物量在不完全接触下分别显著增加了109.38%，97.56%，97.32%，在根系无接触下分别显著增加了275.00%，287.80%，177.68%，3种处理间差异显著(P<0.05，图2A，图2B，图2C)。与根系自由接触相比，鬼针草的根生物量、茎生物量、叶生物量在不完全接触方式下分别增加了647.50%，764.91%，744.33%(P<0.05)，在无接触方式下分别增加了615.38%，785.95%，646.39%(P<0.05，图2A，图2B，图2C)。但柱花草和鬼针草的根冠比在3种根系接触方式间均无显著差异(图2D)。

图2 不同根系接触方式下柱花草和鬼针草的根生物量(A)、茎生物量(B)、叶生物量(C)、根冠比(D)的变化

2.2.3不同根系接触方式下柱花草与鬼针草竞争效应的差异 柱花草相对产量(RYS)、鬼针草相对产量(RYB)以及竞争平衡指数(CB)在不同根系接触方式下具有显著差异(P<0.05，表2)。根系不完全接触和无接触的RYS均显著大于1(P<0.05)，而自由接触的RYS显著小于1(P<0.05)，且三者间的差异显著(P<0.05)。根系自由接触的RYB显著小于1，与RYB均大于1的根系无接触和不完全接触方式相比差异显著(P<0.05)。RYT在3种根系接触方式下均无显著差异，但仅根系无接触下柱花草与鬼针草间无竞争作用(RYT>1)。柱花草的CB在不完全接触中显著大于0，在自由接触中CB显著小于0，3种处理间差异显著(P<0.05)。

表2 不同根系接触方式下柱花草与鬼针草的竞争指标

3 讨论

自然环境条件下多种因素共同作用，影响植物之间的相互关系，不但使作物和杂草间的种间关系更加复杂、不可预测和高度可变[25]，也使根系分泌物在植物生长中的作用难以明确[26]。本文通过营养液水培试验，分别将柱花草和鬼针草幼苗的根系暴露在之前生长过对方植株的液体介质中，使幼苗彼此之间植株体不直接接触，但其生长受原先植株的根系分泌物的影响，探究根系分泌物对彼此的相互作用。研究结果发现，与在自我根系分泌物中生长相比，鬼针草根系分泌物影响下柱花草幼苗的根长和侧根数显著增加，柱花草根系分泌物影响下鬼针草幼苗的根鲜重和根冠比显著增加，而两者的苗高、苗鲜重和总鲜重均减少，说明即使在土壤生物和非生物因子受到控制、养分资源充足、植物根系间的物理作用被消除的情况下，植株生长也会受到根系分泌物的影响。这与Biedrzycki等[27]、Yang等[28]将拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh)和水稻(OryzasativaL.)暴露在不同根系分泌物中生长获得的结果一致。前人研究指出，植物通过根系分泌物识别邻居的存在后能促进自身根系的生长，从而使其获得较高的竞争能力[29]。因此本研究中柱花草和鬼针草的地下部形态均显著变化的原因可能是识别到异种植物根系分泌物后受体植物为提高竞争力作出的响应。鬼针草根系分泌物对柱花草幼苗的化感综合效应为促进，而柱花草根系分泌物对鬼针草幼苗的化感综合效应为抑制，说明无其他因素影响下柱花草能利用根系分泌物抑制鬼针草的生长，在检测到鬼针草根系分泌物时自身生长特别是根系生长增强。

面临资源竞争、杂草危害等生存压力时，栽培植物能够通过根系分泌物识别邻居植物的身份，调整自身的根系生长模式及表型可塑性，在与相邻植物的竞争中获得生存优势[17,30]。为探究根系分泌物对栽培牧草与杂草在实际生长竞争中种间关系的具体作用，本研究在考虑环境、化感作用等因素的基础上利用3种根系接触方式探究了不同根系接触和根系分泌物交流程度对柱花草与鬼针草的早期种间相互作用的影响。根系间完全无接触后，柱花草和鬼针草的根长、分枝数、各部分生物量均显著高于根系自由接触，且二者的相对产量总和为1.10，说明柱花草与鬼针草间的相互干扰主要取决于根系接触和根系分泌物交流，与地上部的交流和接触程度并无紧密关联。根系间仅根系分泌物可以自由交流时，柱花草和鬼针草的根长、根体积、各部分生物量均显著高于根系自由接触，这一试验结果不但从侧面佐证了张淞著[31]关于植物根系对资源的竞争过程主要通过根系空间的重叠达到这一结论，也说明此时柱花草和鬼针草的种间相互作用主要是根系分泌物介导的化感作用；此时柱花草的竞争平衡指数显著大于0，说明柱花草的生长占优势，这与水培试验结果相一致，也再次佐证了根系分泌物在植物相互作用中发挥关键作用[32]。Yang等[30]研究发现，水稻和杂草的根系间仅根系分泌物可以自由交流时，水稻根系分泌的化感物质含量比直接接触时显著增加，对稗(Echinochloacrusgalli(Linn.)Beauv.)、鳢肠(Ecliptaprostrata(Linn.)L.)和千金子(Leptochloachinesis(Linn.)Nees)等杂草的化感抑制作用显著增强；Khanh等[33]已经证明柱花草是具有强烈化感作用的植物之一，其根系中水杨酸、总酚、类黄酮等次生代谢产物丰富[33-34]，据此我们推测，根系间仅根系分泌物自由交流时柱花草根系分泌的抑制鬼针草生长的化感物质也可能增多，需要进一步试验验证。

根系间自由接触时，柱花草的竞争平衡指数显著小于0，柱花草的生物量分配策略无显著变化，而鬼针草的生长占优势，向地下部的生物量分配增大，结合水培试验鬼针草根系分泌物对柱花草的化感作用相对较弱的结果，说明此时牧草与杂草的种间关系是资源竞争和化感作用共同作用的结果[35-36]，但柱花草与鬼针草种间关系中起主要作用的是种间竞争，对地下空间和养分的竞争能力增强使鬼针草在种间干扰中占优势，根系间不能自由接触打破了二者间的化学适应和根系相互作用的平衡，柱花草通过合成和释放根系分泌物的方式调节其与鬼针草的竞争关系，以响应根系间相互作用的改变。因此根系间通过根系分泌物发生的化学作用在柱花草与鬼针草种间关系中发挥着重要作用。

4 结论

通过水培和3种根系接触方式的盆栽生长试验，我们发现‘热研2号’柱花草与鬼针草的种间关系是竞争作用和化感作用共同作用的结果，种间相互作用主要发生在根系，根系分泌物在二者种间关系中起关键调控作用。其中，柱花草的种间干扰主要体现在通过根系释放的分泌物对鬼针草的化感抑制方面，且这种干扰作用在根系不直接接触状态下能够增强，而鬼针草通过加大地下生物量分配这一策略来抵御柱花草对其的化感干扰，从而增强其对资源的竞争能力。柱花草种植与管理过程中，在密切关注柱花草与杂草的土壤养分和水分竞争情况的同时，还要关注根系分泌物介导的化感作用，通过科学利用化感抑制作用来提高牧草产量和质量，实现杂草可持续防控。