小反刍兽疫研究进展

肖卫华，郭田华*，于小静，程晓辉

（1.遂川县农业农村产业发展服务中心，江西 吉安，343900；2.中国动物卫生与流行病学中心；3.吉林省牧业信息中心）

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）引起的一种急性接触性传染病，主要感染山羊、绵羊和野生小反刍动物。PPR是世界动物卫生组织（OIE）规定的法定报告动物疫病，由于可能对多个国家的经济、贸易和粮食安全造成破坏性影响，联合国粮农组织（FAO）将PPR列为跨界动 物 疾 病(Transboundary Animal Disease，TAD)[1]。2015年FAO和OIE联合启动了《小反刍兽疫全球控制和根除战略》，计划将于2030年根除PPR。该战略分为四个阶段，分别为评估阶段、控制阶段、根除阶段和根除后阶段。

PPR是威胁发展中国家养羊业健康发展的重要因素之一，1942年在非洲西海岸象牙海岸（科特迪瓦）首次发现PPR，随后向非洲东部扩散至苏丹、埃塞俄比亚等国家。1987年传入亚洲，1999年传播至欧洲（图1）[2]。2007年7月，我国西藏阿里地区首次发生PPR疫情，当时针对疫情实施了全国监测计划，由于西藏地区的天然地理隔离屏障以及紫外线强烈等环境因素，没有发生大规模的传播。直至2013年11月在新疆维吾尔族自治区伊犁州又暴发了PPR疫情，此次疫情传播至全国22个省市自治区[3]。我国暴发的两次疫情中病毒分离株与邻国Ⅳ系的分离株关系密切，但不在同一分支[4]。我国将PPR列为一类动物疫病。

图1 全球暴发PPR疫情暴发时间轴

1 病原学

1.1 病毒分类地位与分子结构

PPRV属于副黏病毒科、麻疹病毒属。与牛瘟病毒（RPV）、麻疹病毒（MV）、犬瘟热病毒（CDV）等同属其他病毒有密切的抗原关系。PPRV为单股负链有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径介于400~500nm之间。电镜下观察到PPRV囊膜厚度约8~15nm，囊膜上有两种长度在8.5~14.5nm之间糖蛋白纤突。根据开放阅读框架和RNA编辑的不同，可编码8种蛋白，包括6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白）、基质蛋白（Matrix Protein，M蛋白）、聚合酶或大 蛋 白 （Large protein，L蛋 白）、 磷 蛋 白（Phosphoprotein，P蛋白）、血凝素（Hemagglutinin protein，H蛋白）和融合蛋白（Fusion protein，F蛋白），以及2种由P基因编码的非结构蛋白（C蛋白和V蛋白）。N、P和L蛋白分布于核衣壳，共同作用完成PPRV的转录与复制；H和F蛋白可介导病毒吸附融合，这2种蛋白在囊膜上可形成糖蛋白纤突；位于囊膜内侧的M蛋白主要在病毒出芽过程中发挥作用。根据N蛋白和F蛋白可将病毒分为4个谱系（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。Ⅰ系和Ⅱ系主要流行于西非，Ⅲ系主要在阿拉伯、东非流行，Ⅳ主要流行于亚洲，后逐渐传入非洲[5]。PPRV全基因长15948bp，是麻疹病毒属中最长的病毒[6]，与同属其他成员一样，PPRV具有六碱基原则，是保证病毒基因组有效复制的必要条件。

1.2 病毒理化特性

PPRV抵抗力较弱，对紫外线以及酒精、乙醚和苯酚等化学物质敏感，大多数的化学灭活剂，如酚、2%NaOH作用24 h可以灭活病毒[7]。处于50℃下30 min病毒感染能力消失，温度超过70℃病毒失活。

2 流行病学

2.1 传染源

带毒动物是主要传染源。病羊的眼、鼻、口排出带有毒素的分泌物将饲料、垫料以及水槽等物品污染后，易感动物可能与这些污染物发生密切接触而感染。本病发生无明显季节性，一年四季均可发病，但多雨和干燥寒冷季节时为本病的高发期。PPR的病程表现根据病毒毒力、发病季节、感染动物品种和年龄以及感染动物免疫状况和是否有并发感染等因素的影响而不同，可将其分为特急性行、急性型、亚急性型和亚临床型四种类型，通常以急性型为主。

2.2 传播途径

主要通过呼吸道和消化道感染，并在短时间内侵袭其他重要器官。呼吸系统是该病主要传播途径。除此之外，PPR也可以通过感染动物的精液、胚胎和母乳喂养传播。在自然界中，野生动物跨越边境迁徙是PPR跨界传播的一个潜在原因。土耳其有报道蠓有作为媒介传播PPRV的可能性[8]。交易后的牲畜运输也被视为PPRV传播的重要途径。疾病的传播具有明显的定向传播，日平均温度、日平均相对湿度和每日日照时间与PPR爆发的风险呈负相关，而日平均气压存在正相关关系，气象因素可能是影响PPR传播的重要变量[9]。

2.3 易感动物

PPRV的宿主广泛，主要自然宿主是绵羊和山羊，山羊较绵羊更易感。此病不感染人。幼龄动物发病率和死亡率更高，处于哺乳期以及3~18月龄的幼龄羊更易感染。野生反刍动物在PPRV的传播中可能会威胁濒危野生动物。许多野生反刍动物，例如羚羊、白尾鹿、努比亚野山羊、亚洲狮等也会感染本病，骆驼也可感染本病[10]。

3 诊断

3.1 临床症状与病变

潜伏期通常为4~6d，平均潜伏期为4d。PPR临床症状与蓝舌病、山羊/绵羊痘、传染性山羊胸膜肺炎等疫病相似。山羊的临床症状更为典型。感染PPRV动物临床症状表现为何种类型主要取决于感染病毒株的毒力大小、感染种群的类别以及疫苗毒和野毒的抗体[4]。PPR急性型在临床上通常表现持续高热（40℃以上）并伴有厌食、精神沉郁、脱水、口鼻分泌物增多等症状，口鼻分泌物逐渐变为粘液脓性，并伴有大量流涎，也会出现嘴唇和牙龈口炎，并可能出现坏死性病变。还会导致细菌继发感染的临床症状并发症[11]。在疾病的后期，动物会出现腹泻和咳嗽，并伴有费力的腹式呼吸。最终动物可能会出现呼吸困难、消瘦，直至死亡。病理变化通常表现口腔黏膜、肺和肠黏膜上皮细胞发生病变，形成多核合胞体细胞的嗜酸性包涵体。胃肠道和呼吸系统的淋巴组织和上皮细胞退化并出现坏死。剖检可见肺充血、胃肠道和鼻窦充血、水肿，咽后淋巴结和肠系膜淋巴结充血、肠黏膜线性出血和脾脏肿大。淋巴结、其他淋巴组织和消化道器官是病毒复制的主要部位[12]。

3.2 实验室诊断

3.2.1 病毒分离培养。病毒分离鉴定是PPRV检测的基本方法，但耗时长，灵敏度低。PPRV既能够在绵羊或山羊的原代细胞中分离和培养，也可以在传代细胞，如Vero细胞、MDBK、BHK-21、BSC猕猴肾细胞以及CHS-20细胞中进行增殖。患病动物的眼、鼻、口和直肠分泌物的拭子，淋巴结、扁桃腺、脾、肺、大肠等组织以及血液样本均可以进行病毒分离试验，其中鼻拭子是诊断PPRV最合适的样本。接种后细胞在6~15d发生病变出现多核细胞，若在5~6d后细胞仍无变化则需要进行盲传，直到出现细胞病变效应（CPE）。

3.2.2 病原学诊断。John Flannery等人建立了基于PPRV F基因的RT-qPCR检测方法[13]，具有100%的特异性,敏感性最低检测限为10copies/μL，对于未发生临床症状的动物具有足够高的灵敏度。Rajko-Nenow Paulina等人针对PPRV N基因设计6条特异性引物建立RT-LAMP检测方法[14]，在65℃20min即内可得到检测结果，与实时荧光RT-PCR相比有100%的特异性和接近97%的敏感性。实验验证最早可在感染4d后检测到PPRV，RT-LAMP的成本相比于RT-PCR来说较低，适用于欠发达的地区。Zhang Y等人根据PPRV N基因设计用于RPA的引物[15]，用于RT-RPA和实时RT-RPA检测，常规RT-RPA在41℃20min条件下检测到852copies，实时RT-RPA在39℃20min条件下每个反应中检测到103copies。两种方法均不与BVDV、IBRV、CDV、NDV、FMDV等病原体发生交叉反应。Yuanli Li等同样针对N基因进行研究[16]，在不与其他病原体发生交叉反应的前提下，建立了实时RT-RPA检测方法，在42℃20min时检测限为14.98 copies和基于质粒拷贝数和组织培养感染滴度0.326 TCID50/mL，灵敏度更高。Mahapatra Mana针对N基因C端保守区设计的引物组N1197F/N1658R进行第一步RT-PCR扩增[17]，再使用引物NP3/NP4（诊断实验室广泛使用）进行巢式PCR，该方法针对于弱阳性的样本和病毒含量较低的环境样本能够扩增出较强的目的条带，并可用于测序。

3.2.3 血清学诊断。感染小反刍兽疫后能够终身产生抗体，对再次感染能够产生完全保护，血清学适用于PPR的大规模监测。Balamurugan V等人开发了基于多克隆抗体的间接ELISA方法[18]，间接ELISA与竞争性ELISA相比，有更优的特异性(95.09%)和敏感性(90.81%)。与病毒中和试验（VNT）相比，具有100%的特异性和80%的敏感性。Jialin Zhang等人建立了能够稳定表达山羊SLAM至少20代的幼仓鼠肾山羊信号淋巴细胞活化分子（BHK-SLAM）细胞系[19]。基于该细胞系和表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组PPRV（rPPRV-GFP），开发了一种用于PPR抗体诊断的免疫过氧化物酶单层测定法（IPMA）。对198份羊血清样本通过IPMA和病毒中和试验(VNT)两种方法进行检测。与VNT相比，IPMA的敏感性和特异性分别为91%和100%，两种方法的符合率为95.5%。IPMA可在4h内完成检测，并且不需要抗原纯化。IPMA能够替代VNT用于检测PPRV抗体。琼脂糖凝胶免疫扩散实验（AGID）和对流免疫电泳（CIE）在早期的诊断中使用广泛，但是这两种方法难以检测PPRV抗原含量较低的样品。

4 预防与控制

4.1 疫苗的开发

4.1.1 减毒活疫苗。PPRV与同属的RPV关系密切，早期对PPR的防控就是使用RPV减毒活疫苗作为异源疫苗[20]，但考虑到根除牛瘟期间的安全性便被禁止使用。Nigeria 75/1最初是从一只患病的尼日利亚山羊中分离，并在Vero细胞中连续传代至80代以减弱其毒性，1989年弱毒疫苗Nigeria 75/1问世；1996年印度分离株在绒猴淋巴母细胞系上连续传代59代，获得减毒活疫苗Sungri 96，至少能提供6年的有效免疫。sungri 96和Nigeria 75/1是目前使用最多的疫苗，都可以诱导针对PPRV四种谱系的保护性免疫[21]。sungri 96主要用于印度和不丹，而Nigeria 75/1常用于非洲、中东和亚洲部分地区。但是减毒活疫苗无法区分自然感染动物和疫苗接种动物。而且减毒活疫苗保留有毒力，存在毒力反强的风险。我国使用的是PPRV-Clone 9株开发的疫苗，目前已用于国内PPR防控。PPRV易变异，最好使用当地分离株制备的特异性疫苗。从流行病学控制和监测的角度分析，减毒活疫苗并不是最理想的疫苗，尤其是在动物流行病暴发时。

4.1.2 重组亚单位疫苗。重组亚单位疫苗由病原功能性结构蛋白制成，H蛋白和F蛋白均能够激发保护性免疫，是研究PPRV重组亚单位疫苗优选靶蛋白。使用高宿主特异性的山羊痘病毒作为重组疫苗载体，构建了含有PPRV F蛋白基因cDNA的重组山羊痘病毒疫苗。表达PPR F蛋白的山羊痘病毒重组体可以保护山羊避免感染PPR和山羊痘，0.1 PFU重组剂量能够保护山羊避免感染PPRV[22]。

4.1.3 病毒样颗粒疫苗。病毒样颗粒疫苗具有很强的抗原性，容易被抗原呈递细胞和B细胞识别，能够诱导强烈的体液和细胞介导的免疫反应。病毒样颗粒疫苗是相对安全的，因为在没有遗传物质的情况下不会发生病毒复制。用杆状病毒表达系统开发了PPRV病毒样颗粒疫苗，可以在昆虫细胞中同时表达PPRV M、H、F和N蛋白。用PPRV病毒样颗粒疫苗（VLPs）免疫小鼠和山羊可引起强烈的中和反应和细胞免疫反应。对小鼠研究发现，VLPs在CD4和CD8 T细胞中诱导了比在Nigeria75/1中更强烈的IFN-γ反应。对山羊的研究表明，PPRV VLPs可以诱导产生F和H蛋白特异性抗体，还可以刺激产生与Nigeria75/1疫苗相同数量的病毒中和抗体。这项研究证明病毒样颗粒疫苗可在小型反刍动物中引发有效免疫应答[23]。

4.1.4 活病毒载体疫苗。是研制DIVA疫苗最有希望的方法之一，由于可携带单一保护性抗原基因，诱导的免疫反应不同于自然感染情况，从而可区分免疫动物和自然感染动物。这类疫苗目前还处在研究阶段，H和F糖蛋白是最佳候选疫苗蛋白，目前已在痘病毒、腺病毒、新城疫病毒以及牛疱疹病毒重组的复制缺陷病毒载体中表达。

4.1.5 DIVA疫苗。含有遗传标记的重组疫苗能够区分自然感染动物和疫苗接种动物。Parida S等人开发了重组减毒PPR DIVA活疫苗和DIVAELISA[24]，并在山羊体内进行安全性和有效性评估。这两种DIVA疫苗都是安全有效的，并且与Nigeria 75/1和Sungri 96减毒活疫苗有相似效力。

4.2 防控

目前带毒动物输入主要是野生动物越境与家畜接触以及进口带毒家畜，没有发生过PPR疫情的国家和地区应采取预防控制措施；已经消灭PPR的国家要加强境外输入的防控，严格限制从流行地区进口牲畜及其动物产品。对于新引入群的动物进行至少隔离2~3周的检疫。野生动物会对本地动物构成威胁，应避免野生动物接触家养动物。定期监测易感动物，若发生PPR的临床症状，要将患病动物隔离饲养。

完成全球范围内根除PPR的计划，还需要对PPRV在野生动物中的传播机制进行深入研究，防止自然疫源地的形成。在非洲和南亚一些欠发达的地区，他们没有足够的资金和技术支持，所以需要开发能够方便使用、检测结果稳定准确、价格低廉且易操作的检测方法，以及无需冷藏的冻干疫苗。在流行地区，接种疫苗是控制PPR最实用的方法[25]，为确保特定流行病学动物的传播控制，需要至少70%的疫苗接种免疫率。提高疫苗覆盖率，加强风险地区的疫苗接种，是长久有效保护易感动物健康的有效方法。