Sonic hedgehog信号通路中Gli蛋白活化和肿瘤相关性的研究进展*

曾莉莉， 董洪亮， 陈微微， 马向瑞， 杜 静△

滨州医学院附属医院1口腔颌面外科3医学研究中心，滨州 256600 2滨州医学院口腔医学院(烟台)，烟台 264000

Hedgehog(Hh)信号通路第一次被发现是在对果蝇胚胎发育的研究当中，Nusslein-Volhard和Wieschaus两位学者在研究果蝇的胚胎致死突变体中首先分离鉴定出了Hedgehog基因[1]。该信号通路在结构和功能上都非常保守，是一种配体依赖性信号通路，并且它还参与了脊椎动物的多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长分化和肿瘤发生发展等[2]。多项研究结果表明，Sonic hedgehog(Shh)信号通路是参与体内多种癌症发生发展的Hh信号通路中的重要组成成分，而神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue，Gli)也被证明在Shh信号转导途径中发挥了不可或缺的作用。这些年来，针对该信号通路的靶向抑制剂研发成功的案例越来越多，使得Shh信号通路与肿瘤的关系再次进入学者们的视野。本文将就Shh信号通路中的Gli蛋白与肿瘤的相关性以及Gli蛋白靶向抑制肿瘤的研究进展作一总结。

1 Sonic hedgehog信号通路

此前在脊椎动物中已经检测出3个果蝇同源Hh基因，它们都可以编码一种叫做Hh配体的糖蛋白，这种蛋白同时还具有分泌功能和自我催化能力[3]。其中，Sonic hedgehog(Shh)在神经系统、肺和牙齿的发育过程中广泛表达，对其形态发育和功能形成发挥了关键作用[4-6]；Indian hedgehog(Ihh)在软骨和骨骼的生长发育当中起着重要调控作用[7]；Desert hedgehog(Dhh)主要在睾丸中表达，是哺乳动物精子发生中的重要调控因素[8]。Sonic hedgehog(Shh)信号通路的主要成员包括Shh配体、跨膜蛋白受体Patched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核转录因子Gli蛋白、Fu抑制剂(suppressor of fused，SuFu)及下游靶基因。Shh配体首先是以前体蛋白的形式生成，在经历了自蛋白水解作用、胆固醇修饰和进一步的棕榈酰化等加工后才具有传递信号的活性作用。氨基端(Shh-N)及羧基端(Shh-C)的两个结构域是由Shh前体的自我裂解产生，其中Shh-N的COOH末端共价结合1个胆固醇分子[9]，然后酰基转移酶将棕榈酰部分添加到N末端的半胱氨酸，生成双重修饰的成熟的Shh蛋白[10]。继而可以在局部分泌，也可以进行长距离扩散。Ptch和Smo是Shh信号向下传递的关键分子，锚定于靶细胞的细胞膜上。Ptch是一种12次跨膜蛋白，由肿瘤抑癌基因Patched编码[11]。目前为止已经发现了的脊椎动物Ptch同源物一共有Ptch1和Ptch2两种。而Smo受体是一种G蛋白偶联受体类似结构的7次跨膜蛋白，由原癌基因Smothened编码[12]。Gli蛋白是具有高度保守的锌指DNA结合结构域的Kruppel样因子家族的成员之一，作为Shh信号通路中的关键转录因子发挥调控作用[13]。Gli1、Gli2和Gli3是目前为止已经鉴定出来的3种脊椎动物Gli蛋白同源物，在这三者之中Gli1是主要激活剂，Gli2和Gli3则充当激活剂和抑制剂的双重角色[14]。Shh信号通路本身的重要成员也是其最主要的下游靶分子，包括Ptch1、Ptch2和Gli1基因。Ptch1、Ptch2和Gli1可以作为Shh信号通路激活的可靠指标，并起到负调控(Ptch1)和正调控(Gli1)的作用[15]。

脊椎动物中Shh信号向下传递时，它在细胞内亚细胞器的位置会随时发生改变，主要在初级纤毛或纤毛附近聚集。初级纤毛是位于脊椎动物细胞表面突出的部分，作为Shh信号转导的信号中心发挥作用。当没有Shh配体存在时，Smo的活性被Ptch抑制，从而不能顺利进入纤毛发挥激活作用。Gli则与SuFu组成蛋白复合物，该复合物被蛋白酶水解并释放出Gli阻遏物(GliR)，同时SuFu抑制细胞质中的Gli蛋白并促进其与转录共抑制因子的结合，进而导致目标基因的转录抑制[16]。当有Shh配体与Ptch结合时，Smo的抑制作用被去除，同时也激活Smo离开胞膜进入原纤毛[17]，加速了Gli蛋白与SuFu的解离入核，从而引起下游靶分子一系列的转录活动[18]。Shh信号的异常激活可分为Shh依赖型和Shh非依赖型，同时又被称为经典型和非经典型。Shh信号通路成分的突变是非依赖型的主要发生形式之一，比如Ptch基因和Smo基因的突变可以导致基底细胞痣综合征[19-20]，SuFu突变可以导致髓母细胞瘤的发生[21]。见图1。

图1 脊椎动物中的Shh信号通路Fig.1 The sonic hedgehog signal pathway in vertebrates

2 Gli蛋白

Gli蛋白是Kruppel样因子家族的成员，脊椎动物中含有的3种Gli蛋白都具有上游的N端结构域、中央高度保守的锌指结构域(zinc-finger domain，ZFD)以及下游的C端结构域，三者N端和C端结构域的不同决定了3种蛋白各自功能的独特性。此外，它们都含有一个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)、核输出信号(nuclear export signal，NES)和SuFu结合域(SuFu binding domain)。Gli1缺少阻遏物域，其介导的转录受其C末端反式激活域(transactivation domain，TAD)中的多个区域调控，Gli1的C末端TAD区(539～1106 aa)具有非常强的转录活性。SMARCA2是Gli1活性的共激活因子，它与Gli1-TAD中的特定结构域相互作用而激活其转录活性[22]，而Gli2和Gli3是通过其N端的阻遏结构域(repressor domain，RED)来调节活性。Sasaki等[23]的研究很好地证明了这一点，他们在培养的大鼠神经干细胞系MNS70中截断一半的C末端激活域，产生了具有阻遏物活性的蛋白质，而N末端的抑制域被去除时，则将Gli2转化为强激活剂。在Gli3中也发现了涉及N末端区域的类似调节机制，而在Gli1中却没有发现。Gli2同时含有阻止和激活结构域，但是其加工成抑制形式Gli2R的效率低下以及容易被蛋白酶体降解，因此大多数情况下Gli2充当了激活转录因子的角色。Gli3包含一个位于C末端大约200个残基的加工决定簇域(processing determination domain，PDD)，因此可以有效加工成阻遏物Gli3R[24]。总的来说，Gli1激活特定目标基因的转录，而Gli2和Gli3则充当转录激活因子(全长，以Gli2为主)或C端截短的阻遏物(以Gli3为主)。见图2。

图2 Gli蛋白的结构Fig.2 The structure of Gli protein

Gli蛋白在翻译后被广泛修饰，这些修饰很大程度上决定了它们在细胞中的运输以及最终的转录输出形式。磷酸化是目前研究最多最彻底的Gli蛋白修饰，其中多种激酶都与Gli蛋白的活性调节相关，包括糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)、双特异性酪氨酸调节激酶(dual-specificity tyrosine-regulated kinases，DYRKs)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)等。Gli蛋白活性受脊椎动物Hh信号转导中的多位磷酸化控制，它调节控制阻遏物(GliR)和激活物(GliA)形式的产生，PKA含有的6个Gli蛋白磷酸化位点(P1～P6)是其转录活性的决定因素[25]。具体而言，在不存在Shh配体的情况下，PKA使Gli2/3上的位点P1～P6磷酸化，随后CK1和GSK3β磷酸化，从而触发蛋白酶体加工成GliR抑制下游靶基因的转录激活[26]。Gli1蛋白不经历PKA依赖型蛋白水解加工成阻遏物，但其PKA位点S544和S560也参与抑制Gli1的活性[27]。DYRKs也可以参与调节Gli蛋白的活性，Ehe等[28]研究发现DYRK1A可以直接参与调节Gli1蛋白在Ser408处的磷酸化，促进Gli1在细胞核中的定位及其转录活性。另一方面，DYRK1B通过阻止其蛋白酶体降解来增强Gli1蛋白的稳定性[29]。除此以外，Han等[30]通过体内和体外实验证明Fused/Unc-51 like kinase(Fu/ULK)激酶家族能够介导Gli蛋白的磷酸化和激活。

除了蛋白激酶以外，蛋白磷酸酶在调节Shh信号传导中的作用也不容小觑，尤其是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，因为Shh途径中大多数已知的磷酸化事件可以在丝氨酸或苏氨酸残基上发生。在真核生物中，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2，PP2A)和蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4，PP4)都有表达，它们作用于Shh信号通路不同的位置[31]。PP2A是Shh途径中最受研究关注的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。PP2A负调控Gli3蛋白，主要参与Gli3的核定位和转录活性的调节[32]，但其具体作用于Gli3的哪个位点目前还不是很清楚。同时蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4，PP4)也可以通过促进SuFu的去磷酸化增强Gli1的转录活性[33]。

3 Gli和肿瘤发生发展的关系

Shh信号通路对于正常组织细胞的生长分化起着不可或缺的调控作用，一旦某一基因成分发生突变或异常就会激活该信号通路。大量研究显示人体多种肿瘤的形成都涉及Shh信号通路的异常，其中Gli蛋白可能通过增强癌细胞的增殖、存活、干性、转移潜力或刺激基质和血管形成而促进癌变或加速肿瘤生长。

3.1 肿瘤发生

已有研究证实多种正常人体组织细胞的致癌过程都存在Gli蛋白激活入核。最近的一项对乳腺癌细胞中Gli蛋白与雌激素受体(estrogen receptor，ER)的研究表明，雌激素受体可以与Gli3结合并激发其活性，并且Gli3是乳腺癌细胞生长所必需的[34]。此外，有学者通过免疫组织化学的方法比较了卵巢高级别浆液性腺癌组织与正常输卵管组织中的Shh信号激活情况，发现卵巢高级别浆液性腺癌组织中Gli1的表达量比正常输卵管显著增加[35]。同样，在对36例小细胞肺癌的石蜡组织进行免疫组化分析时发现12例中的Gli1蛋白表达比例较高，且Shh过度表达与预后不良相关[36]。以上研究都充分说明了Gli蛋白参与了多种肿瘤的发生，并在相关肿瘤中明显高表达。

3.2 肿瘤进展(转移)

Gli蛋白的激活不仅涉及肿瘤的发生，还与肿瘤的进展有关。Ke等[37]的一项研究证明在胃癌组织中存在有Shh/Gli1途径异常激活的情况，并可能通过诱导上皮-间充质转化来促进胃癌细胞的浸润与转移，其中伴随着Gli1的表达上调。此外，另有一项研究结果提示Shh/Gli1和Wnt/β-catenin途径的激活可以促进黑色素瘤的转移和血管生成[38]。

3.3 肿瘤耐药

多重耐药是影响抗肿瘤治疗效果的不利因素，因此寻求能够逆转多重耐药的小分子化合物成为当前亟须解决的重要问题。目前有许多学者都在积极地探寻引起肿瘤耐药的机制，以便更好地针对性逆转耐药现象。Yu等[39]的一项研究表明，Gli1介导的侧群调节可能是胃癌耐药的原因。另外一项研究发现Smo基因扩增和Shh通路激活是人类肺癌抗表皮生长因子受体药物的新耐药机制[40]。

一项探讨Hedgehog/Gli1信号通路在调节骨肉瘤顺铂耐药中相关作用的研究发现，Gli1在骨肉瘤细胞的顺铂耐药中起促进作用[41]，Gli1也能够直接介导结直肠癌治疗中氟尿嘧啶的耐药性[42]，因此降低Gli1的表达量有望成为一种新方法，从而逆转多重耐药性和增加化疗成功率。目前也有针对肿瘤耐药的小分子抑制剂出现，溴结构域抑制剂IBET-151可以通过降低Gli信号来抑制vismodegib(Smo抑制剂)耐药的食管腺癌生长[43]。

4 Gli和肿瘤干细胞

目前肿瘤治疗的最大难题还是原发肿瘤经手术切除后的转移和复发，其中癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)是肿瘤抵抗力和复发的主要来源。大量研究表明，Shh通路参与调节包括前列腺癌[44]、肺癌[45]、乳腺癌[46]和白血病[47]等多种肿瘤干细胞的维持，促进其自我更新。Gli蛋白通过调节干细胞性相关基因同源盒蛋白(nanog homeobox，NANOG)，性别决定区Y-box蛋白2转录因子(sex-determining region Y-box protein 2，SOX2)，myc原癌基因蛋白(myc proto-oncogene protein，c-Myc)和八聚体结合转录因子4(octamer binding transcription factor 4，Oct-4)等的表达而有助于CSC的自我更新[48]。例如，Gli1介导的SOX2调节可以促进肺癌干细胞样细胞的自我更新，并使其在长时间的临床治疗过程中获得对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂的耐药性[49]。此外，Gli蛋白还可以通过靶向NANOG来影响上皮性卵巢癌的干性及恶性程度[50]。因此，有学者提出通过化疗可以影响肿瘤微环境的改变从而上调转录因子Gli1的表达，进而导致肿瘤干细胞样特征的诱导和卵巢癌的转移。因此抑制Gli1就可能逆转化疗后CSC样特征加重并阻止卵巢癌细胞迁移[51]。

5 针对Gli蛋白的靶向治疗

如今市场上已经有许多靶向Shh信号途径的抑制剂出现，大多数都属于Smo抑制剂。其中LDE225/sonidegib和GDC-0449/vismodegib两种Smo抑制剂在基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的临床治疗中都取得了不错的效果，因此被FDA批准用于治疗该类患者。但是，也有一些使用了Smo抑制剂的患者出现了复发及耐药现象，其可能与Shh通路重新激活有关，主要原因是药物靶标Smo的突变，也有部分是因为同时改变SuFu和Gli2的拷贝数造成的[52]。这表明需要以靶向Shh通路多个水平上成分的疗法组合来克服耐药性。因此，Smo下游的Gli抑制剂就成为了研究关注的重点。

GANT61是目前针对Gli1和Gli2的小分子拮抗剂，它在细胞核中阻止Gli与高度保守的DNA序列结合，其中GANT61对Gli1的特异性更高。在GANT61处理的细胞中Gli1的DNA结合显著降低，这表明GANT61可能会诱导Gli1的翻译后修饰，从而阻止DNA结合或破坏Gli1-DNA复合物的稳定[53]。而Dash等[54]筛选出一种Gli1高亲和力的小分子抑制剂8-羟基喹啉，它不会阻止Gli1与DNA的结合，也不会破坏Gli1-DNA复合物，而是诱导整个复合物中的特定构象变化，从而阻止Gli的正常功能。目前，GANT61在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌和口腔鳞状细胞癌中都已显示出靶向Gli的特异性抑制作用[55-58]。另外，三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)也显示出对Gli的抑制性，它通过下调Gli1的表达来抑制肿瘤干细胞样细胞发挥作用[59]，也有学者指出ATO通过取代Gli锌指蛋白中的锌离子而使Gli1锌指肽结构重组，从而使其失活抑制Shh通路[60]。靶向Gli的其他抑制剂还包括有扑蛲灵(Pyrvinium)、吡非尼酮(Pirfenidone)和咪喹莫特(Imiquimod)等，目前只有ATO、吡非尼酮和咪喹莫特已经进入了不同类型癌症的临床试验，其余药物还需要经历一段时间的深入研究才能投入到安全使用当中。

6 总结和展望

在Shh信号通路转导过程中Gli1发挥着最关键的调节作用，其表达激活可以通过多种不同的途径来促进癌症的发生与进展。如今大量的研究结果都证实了靶向Gli1蛋白可以阻止人体多种肿瘤的发生发展，但Gli蛋白到底是如何发挥其调控作用还有待于更加深入的研究。虽然现在已经有多种靶向Shh信号通路的小分子抑制剂正在研发或使用，但其临床治疗效果还不是很显著，还需要进行更多的临床试验进行验证，尤其是靶向Gli蛋白的抑制剂的临床应用。