胆囊收缩素通过胆囊收缩素受体A减弱炎症反应降低脂多糖诱导的急性肺损伤*

谭 媛， 廖勇杰， 岳嗣凤

桂林医学院附属医院新生儿科，桂林 541001

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)表现为胸部X线片显示双侧肺弥漫性浸润，动脉血氧分压与吸入血氧浓度比值(PaO2/FiO2)≤300 mmHg和肺动脉楔压(PAWP)≤18 mmHg或临床无左心房高压证据。根据PaO2/FiO2比值差异分为轻度、中度、重度急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，PaO2/FiO2≤300 mmHg为轻度；PaO2/FiO2≤200 mmHg为中度；PaO2/FiO2≤100 mmHg为重度。ALI发生过程中，炎症紊乱导致肺内皮和上皮屏障破坏，其细胞层面变化表现为肺泡-毛细血管膜完整性丧失，中性粒细胞过度迁移并引起促炎因子释放[1]。研究发现，新生儿ARDS发展进程迅速，死亡率高，而早产儿由于肺部发育不完全，肺部更易受损[2-4]，肺部感染引发炎症同样是新生儿ARDS的重要发病原因之一[2]。新生儿急性呼吸衰竭(包括ARDS、肺炎等)也常常伴有过度炎症反应，更有动物实验发现，抑制炎症反应有助于减轻新生幼仔肺损伤[5-6]。

胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是一种多肽类激素，其受体有两种，包括胆囊收缩素受体A(cholecystokinin A receptor，CCKAR)和胆囊收缩素受体B(CCKBR)[7]。研究发现CCK能通过抑制炎症和细胞凋亡保护小鼠肝脏缺血再灌注损伤，同时其受体CCKAR表达上调[8]。但CCK与CCKAR是否参与脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的ALI仍未见报道。近年来，随着生物科技的飞速发展，各种新兴手段如基因芯片、高通量筛选等被广泛应用于ALI发病分子机制研究[9]。本研究利用生物信息学手段预测发现CCKAR与LPS诱导的ALI相关，并探讨CCK及CCKAR对LPS诱导的炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自武汉普诺赛生命科技有限公司；支气管上皮细胞培养液(BEGM)Bullet Kit购自Lonza公司；CCK、LPS、MTT试剂及拮抗剂丙谷酰胺(Proglumide)均购自Sigma公司；兔抗人一抗CCKAR、phospho-p65(p-p65)、p65、GAPDH购自Abcam公司，兔抗人一抗phospho-IκB(p-IκB)、IκB和山羊抗兔二抗蛋白抗体购自Cell Signaling Technology公司；BCA试剂盒和RIPA蛋白裂解液购自南京碧云天生物技术公司；ECL发光检测试剂盒购自上海爱必信生物科技有限公司；人IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA Kit购自R&D System公司；过表达质粒载体(pcDNA3.1)购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；Trizol试剂，SuperScriptTMⅣ第一链合成系统，PowerUpTMSYBRTMGreen预混液购自Thermo-Fisher Scientific公司；CCKAR引物：F5′-GACGC-TTCGGTCATTAGA-3′，R5′-GACGCTTCGGTC-ATTAGA-3′；β-actin引物：F5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，R5′-ACTCGTCATACTCCTG-CTTG-3′购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 使用BEGM Bullet Kit培养BEAS-2B细胞，孵育箱培养环境为37℃、5% CO2。当细胞生长至约80%汇合度时，使用0.25%胰酶消化细胞。取对数生长期细胞进行后续实验。

将BEAS-2B细胞分为6组：未经任何处理的细胞为空白对照组(Control)；利用LPS(1 mg/L)诱导BEAS-2B细胞24 h，并命名为LPS处理组(LPS)；将过表达空载体转染至BEAS-2B细胞后，使用LPS(1 mg/L)处理24 h，并命名为CCKAR过表达阴性对照组(LPS+OE-NC)；将CCKAR过表达载体转染至BEAS-2B细胞中，使用LPS(1 mg/L)处理24 h，并命名为CCKAR过表达组(LPS+OE-CCKAR)；BEAS-2B细胞经CCK(10-6mol/L)处理1 h后，使用LPS(1 mg/L)进行24 h诱导，并命名为CCK过表达组(LPS+OE-CCK)；BEAS-2B细胞经CCK(10-6mol/L)和Proglumide(25 μg/mL)共处理1 h后，使用LPS(1 mg/L)进行24 h诱导，并命名为CCK与CCK拮抗剂组(LPS+CCK+Proglumide)。

1.2.2 RT-PCR法检测基因表达水平 利用TRIzol裂解液提取细胞中的总RNA，依据说明书，使用SuperScriptTMⅣ第一链合成系统合成cDNA，使用PowerUpTMSYBRTMGreen检测CCKAR在不同分组中的相对表达水平。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达水平 利用RIPA蛋白裂解液提取细胞中的总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。30 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离后，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育2 h。使用ECL发光检测试剂盒进行显色，曝光。使用Image J软件对蛋白灰度进行半定量分析。

1.2.4 构建过表达CCKAR细胞株 使用SuperScriptTMⅣ第一链合成系统获得CCKAR cDNA，按照说明书将cDNA插入到pcDNA3.1质粒载体上，形成pcDNA3.1-CCKAR过表达载体，再依据Lipofectamine 2000说明书将过表达载体转染至BEAS-2B细胞中。

1.2.5 ELISA检测炎症因子水平 依据说明书使用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α在细胞上清培养液中的分泌水平。

1.2.6 生物信息学分析 通过GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取GSE18341和GSE2411表达数据。选取GSE18341芯片中未处理组小鼠(4个样本；16周)和LPS诱导组小鼠(4个样本)，以及GSE2411芯片中Control组小鼠作为对照组(6个样本)和LPS组小鼠作为实验组(6个样本)，应用GEO在线分析工具GEO2R对各自芯片中的对照组和试验组进行差异分析，以|logFC| > 1.5，P<0.05为筛选条件获得差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 生物信息学预测结果

通过GEO数据库平台检测，GSE18341和GSE2411数据集符合研究标准。对两个数据集进行GEO2R差异分析，分别筛选出238个和120个DEGs，其中GSE18341有220个上调基因，18个下调基因(图1A，P<0.05)；GSE2411有116个上调基因，4个下调基因(图1B，P<0.05)。利用韦恩图对两个数据集获得的DEGs取交集，发现有80个共同DEGs(图1C)。CCKAR是共同下调表达基因，并且在LPS诱导的小鼠急性肺损伤中下调最为显著。

A：GSE18341中DEGs火山图；B：GSE2411中DEGs火山图；C：GSE18341和GSE2411 DEGs的韦恩图图1 GSE18341和GSE2411中差异表达基因Fig.1 Identification of differentially expressed genes(DEGs)in GSE18341 and GSE2411

2.2 过表达CCKAR降低LPS诱导的BEAS-2B细胞存活率和炎症反应

RT-PCR和Western blot结果显示，BEAS-2B细胞经LPS诱导24 h后，CCKAR表达水平下调(图2A、2B，P<0.01)，并且细胞存活率显著下降(图2C，P<0.01)；与LPS+OE-NC组相比，CCKAR在LPS+OE-CCKAR组中的表达水平显著升高(图2D、2E，均P<0.01)，并且细胞存活率显著上调(图2C，P<0.05)。ELISA结果表明，LPS诱导后，BEAS-2B细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌表达水平显著上调(图2F，均P<0.01)；与LPS+OE-NC组相比，CCKAR过表达后LPS诱导的炎症因子表达水平明显下调(图2F，均P<0.01)。

1：空白对照组；2：LPS组；3：LPS+OE-NC组；4：LPS+OE-CCKAR组；A：RT-PCR检测CCKAR mRNA表达水平；B：Western blot检测CCKAR蛋白表达水平；C：MTT检测细胞活力；D：RT-PCR检测CCKAR mRNA表达水平；E：Western blot检测CCKAR蛋白表达水平；F：ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6和水平；*P<0.05 **P<0.01图2 CCKAR在LPS诱导的细胞损伤及炎症反应中的作用Fig.2 Role of CCKAR in LPS-induced cell injury and inflammation

2.3 过表达CCKAR激活NF-κB信号通路

与空白对照组相比，LPS诱导后p-p65/p65和p-IκB/IκB表达比值显著上调(图3，均P<0.01)，而过表达CCKAR显著抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞中的p-p65/p65和p-IκB/IκB表达比值(图3，均P<0.01)。

1：空白对照组；2：LPS组；3：LPS+OE-NC组；4：LPS+OE-CCKAR组；**P<0.01图3 CCKAR在LPS诱导的细胞对NF-κB信号通路的影响Fig.3 Effect of CCKAR on NF-κB signaling pathway in LPS-induced cells

2.4 CCK通过上调CCKAR减弱LPS诱导的细胞损伤及炎症反应

RT-PCR和Western blot结果显示，与LPS单独诱导组相比，LPS和CCK共处理导致CCKAR表达水平显著上升(图4A、4B，均P<0.01)。同时，CCK处理显著提高细胞存活率，抑制LPS对细胞存活率的影响(图4C，P<0.01)；而CCK和CCK拮抗剂Proglumide共处理导致细胞存活率下降(图4C，P<0.05)。CCK处理后有效抑制了LPS引起的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达上调(图4D，均P<0.01)；而同时加入Proglumide后，CCK对炎症因子水平的影响受到抑制(图4D，均P<0.01)。

1：空白对照组；2：LPS组；3：LPS+OE-CCK组；4：LPS+CCK+Proglumide组；A：RT-PCR检测CCKAR mRNA表达水平；B：Western blot检测CCKAR蛋白表达水平；C：MTT检测细胞活力；D：ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平；*P<0.05 **P<0.01图4 CCK通过CCKAR减弱LPS诱导的细胞损伤和炎症反应Fig.4 CCK reduces LPS-induced cell injury and inflammation through CCKAR

2.5 CCK通过上调CCKAR激活NF-κB信号通路

Western blot结果显示(图5)，与空白对照组比较，加入LPS后，p-p65/p65和p-IκB/IκB表达比值均显著升高(均P<0.01)；与LPS处理组比较，LPS+OE-CCK组p-p65/p65和p-IκB/IκB表达比值显著降低(均P<0.01)，而在加入CCK拮抗剂后，p-p65/p65和p-IκB/IκB表达比值显著上调(均P<0.01)。

1：空白对照组；2：LPS组；3：LPS+OE-CCK组；4：LPS+CCK+Proglumide组；**P<0.01图5 CCK对CCKAR激活NF-κB信号通路的影响Fig.5 Effect of CCK on activation of NF-κB signaling pathway by CCKAR

3 讨论

ALI指在严重感染、休克创伤以及烧伤等非心源性疾病过程中，肺泡上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞受到损伤，从而引起弥漫性肺间质和肺泡水肿，导致呼吸衰竭。ALI发展进程中，过度炎症级联反应会导致肺泡-毛细血管结构的完整性破坏。新生儿ARDS病理生理过程中也存在炎症现象[10]。肺上皮细胞是炎症损伤中重要的靶细胞，内毒素(LPS)是组成革兰阴性细菌细胞壁的成分，是刺激ALI等严重炎性疾病的主要因素。因而本文利用LPS诱导肺上皮体外模拟ALI，也可以一定程度上模拟新生儿ARDS。

GEO数据库收录了世界各国研究人员提供的高通量数据，是生物信息学分析研究的重要数据提取来源，为寻求疾病发病机制以及靶点筛选提供了重要依据[11]。此次研究通过数据库筛选出80个ALI样本与正常样本之间的差异表达基因，其中CCKAR为CCK靶点，在炎症过程中同样发挥重要作用，且有研究发现八肽缩胆囊素(cholecystokinin-8，CCK-8)能够减轻LPS诱导大鼠ALI过程中的炎症反应[12]。故而将CCKAR作为此次研究的切入点。

与健康人群相比较，ARDS患者中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平较高[13]，而炎症反应可作为ALI发展过程中的驱动因素[14]。此次研究发现，经LPS诱导后，BEAS-2B细胞中炎症表达因子上调，且CCKAR表达下调。CCKAR是一个G蛋白偶联受体，可通过胞外信号激活发挥抗炎作用[15]。前期研究表明，抑制CCKAR能促进炎症因子如TNF-α、IL-6的产生[16-17]。而本次实验结果发现，过表达CCKAR可减轻LPS诱导的炎症反应。CCK家族参与抗炎和抗内毒素休克过程[18]，在大鼠ALI研究中发现其能够减轻LPS诱导的ALI[12]。本实验发现，CCK处理后减轻LPS诱导的炎症反应，且上调CCKAR表达；而CCK拮抗剂处理下调CCKAR表达并促进炎症反应，表明CCK可能通过刺激CCKAR表达而降低炎症反应，这与之前的研究结果一致[8-19]。此外，CCK处理后，细胞中NF-κB信号通路被抑制，而在同时加入CCK拮抗剂后，NF-κB信号恢复活性。NF-κB是参与炎症反应的重要信号通路，有研究发现，NF-κB影响ALI中的炎症、细胞凋亡以及氧化应激反应[20-21]。NF-κB信号可调节肺内促炎因子的释放，在各种致病因子如LPS作用下，NF-κB的过度活化促进炎症进程，在ALI/ARS中发挥重要作用[22-23]。IκB是NF-κB二聚体的抑制蛋白家族，IκB通过与NF-κB结合阻止其向核内转移发生活化，而磷酸化IκB可以解离NF-κB，进而促进其活化，进一步启动炎症基因转录[24]。研究发现，在LPS诱导的ALI模型中，抑制IκB可以抑制NF-κB的活化进而缓解急性肺损伤[25]。在血管上皮细胞中，CCK-8通过CCKAR和CCKBR显著抑制LPS诱导的NF-κB的活化[26]。

本次研究显示，上调CCKAR能够抑制NF-κB信号通路的激活，进而影响炎症反应，而CCK能够上调CCKAR的表达。而在一些研究中也发现，CCKAR激活能够抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活[27]。由此表明，CCK可能通过CCKAR抑制NF-κB信号通路的激活进而影响炎症反应的发生。

新生儿ARDS严重威胁新生儿生命，多见于足月儿重症肺炎或败血症等重症感染[28-29]。ARDS同样可发生在早产儿身上，且不同于我们已经熟知的常见于早产儿的新生儿呼吸窘迫综合征。严重肺部感染以及脓毒症等可直接或间接引发新生儿ARDS，是威胁新生儿生命的危重疾病[30]。有研究发现在新生小猪ARDS模型中，抑制肺泡上皮细胞过度炎症对保护新生小猪肺部有重要意义[31]。本课题组研究发现CCKAR在LPS诱导的炎症反应过程中发挥作用，而抑制CCKAR可以抑制炎症反应。因而我们推测其在新生儿ARDS中也发挥一定作用，为后期在新生儿ALI/ARDS中的研究以及以该受体为靶点开发药物提供了相关依据。