YAP干扰下调MARCO受体表达抑制肺泡巨噬细胞的吞噬功能*

冀彩丽， 王梓璇， 李 帆， 庞洪源， 苏浩宇， 华梦晴， 宋传旺 △

蚌埠医学院 1检验医学院免疫学教研室，2慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室，蚌埠 233030 3蚌埠医学院口腔医学院，蚌埠 233030

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由于多种因素导致肺组织结构改变而引起的急性进行性呼吸衰竭，严重时可进一步发展成为急性呼吸窘迫综合征。ALI是临床常见危重症，死亡率高达30%～40%，其发病率与死亡率随年龄增长而增加[1-2]。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)是聚居在肺部气道和肺泡腔的一线防御细胞。作为专职吞噬细胞，AMs通过识别和吞噬作用清除气道内随呼吸进入的病原体和颗粒物[3]，并且AMs还通过吞噬损伤、衰老和死亡的细胞在维持肺泡环境平衡和稳定中起重要作用[4]。我们前期的研究表明，ALI小鼠AMs吞噬功能降低[5]，但具体的机制尚不清楚。

Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信号通路下游的主要效应分子，分子量为65 kD，富含脯氨酸。它是调节机体多种生物学功能的转录共激活因子，不仅能对机械信号做出响应，而且能调节细胞的机械骨架[6]。YAP蛋白在心脏、肝脏、肾脏、神经系统等多种器官和组织中发挥着重要作用，它可以通过调控细胞的增殖、分化、凋亡等生物学功能，从而控制器官大小和组织发育稳态。YAP的失调会引起相关基因的表达改变，从而影响细胞的功能[7]。最新的研究表明，YAP可以通过增加丝状伪足的形成从而促进气道上皮细胞(airway epithelial cell，AEC)这种非专职吞噬细胞的吞噬功能[6，8-9]。但目前YAP是否可以调节如AMs这样的专职吞噬细胞的吞噬功能还不甚清楚。

本研究通过流式细胞术和Western blot等技术观察YAP是否可调节AMs的吞噬功能，并对相关机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及急性肺损伤模型的建立

实验动物为昆明种小鼠，购于安徽医科大学实验动物中心，饲养于SPF级环境中。小鼠随机分为2组：正常对照组和ALI模型组。ALI模型小鼠采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，5 mg/kg)经鼻腔1次滴入激发，正常对照组使用PBS代替LPS鼻滴，造模24 h后，取肺泡灌洗液检测。

1.2 实验细胞

小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S为半贴壁半悬浮细胞，从武汉普诺赛生命科技有限公司购入；实验中所使用的原代小鼠肺泡巨噬细胞均为从小鼠肺内分离纯化获得，为贴壁细胞。

1.3 主要试剂

脂多糖购于Sigma公司；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、胰酶消化液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、NP-40裂解液、PMSF、上样缓冲液(5×)、PVDF(聚偏二氟乙烯)膜、超敏ECL化学发光试剂盒、胞质蛋白提取试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；RPMI 1640细胞培养液购于Hyclone公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)多抗、YAP单抗和GAPDH单抗购于Proteintech公司；siRNA引物序列(FAM/YAP/Sc)购于上海吉玛公司；Engreen-R4000 RNA转染试剂购于北京英格恩有限公司；Verteporfin购于MCE公司。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集和原代小鼠AMs的分离

使用颈椎脱位法将小鼠处死，在75%的乙醇中浸泡消毒，使用无菌注射器抽取无菌PBS缓慢注入到小鼠气管内，停留约1 min后再缓慢回抽，重复此步骤约10～15次；将抽出的BALF使用15 mL离心管收集保存备用；离心后的细胞沉淀先经裂解红细胞处理，再离心弃去上清使用培养液重悬细胞沉淀，置于培养皿中进行贴壁分离；4 h后吸弃培养液上清，无菌PBS轻轻冲洗，培养皿中贴壁的细胞即为原代小鼠AMs。

1.5 siRNA转染

将细胞接种在孔板中，当生长达到50%融合度时进行转染；将Engreen-R4000 RNA转染试剂加入无血清培养液中混匀；取siRNA(FAM/YAP/Sc)，加入一定量的无血清培养液，充分混匀；将2种悬液混合，制备成转染复合物；然后将复合物加入到孔板的细胞中；孵育48 h后在荧光显微镜和普通光学显微镜下观察转染效率，提取蛋白质进行免疫印迹检测干扰效率。

1.6 流式细胞术(FCM)检测AMs吞噬功能

将各处理组AMs按照1×105个/孔进行布孔，待细胞贴壁后，将FITC-E.coli与细胞按照10∶1的比例加入到各组中，孵育1 h后每孔加入20 μL 4%的台盼蓝溶液以淬灭细胞外荧光，并使用PBS冲洗残留的E.coli和台盼蓝溶液，再加入0.25%的胰酶消化后收集细胞，加入300 μL多聚甲醛溶液固定细胞，流式细胞仪检测AMs对E.coli的吞噬率。

1.7 蛋白免疫印迹实验(Western blot)

取小鼠AMs(原代AMs/MH-S细胞株)，采用NP-40裂解液提取总蛋白，试剂盒提取胞质蛋白，BCA法进行蛋白定量。蛋白以10%的SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，5%工业脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗(GAPDH 1∶50000，YAP 1∶5000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后与HRP标记山羊抗小鼠二抗(1∶5000)室温孵育2 h，然后使用增强化学发光法曝光显影条带。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 ALI小鼠AMs中YAP蛋白表达降低

本研究采用LPS经鼻滴入气道的方法诱导ALI小鼠模型，LPS滴入24 h后经支气管肺泡灌洗获取原代小鼠AMs。与正常对照组小鼠AMs比较，ALI模型小鼠AMs总蛋白及胞质蛋白中YAP的表达均降低(图1A、1B)。ALI小鼠模型的BALF中TNF-α含量升高[10]，因此我们使用TNF-α(200 ng/mL)刺激MH-S细胞株构建ALI巨噬细胞模型。TNF-α刺激24 h后，MH-S细胞总蛋白和胞质蛋白中YAP的表达均降低(图1C、1D)，与ALI动物模型来源的原代AMs结果一致。上述结果说明ALI环境下AMs中YAP的蛋白表达降低。

A：Western blot检测获取自ALI模型小鼠及正常对照小鼠(Normal)的原代AMs总蛋白和胞质蛋白中YAP蛋白表达情况；B：A实验统计图，与Normal组比较，*P<0.05 **P<0.01；C：Western blot检测经200 ng/mL的TNF-α刺激24 h后的MH-S细胞与未刺激的对照细胞(Control)中YAP蛋白表达情况；D：C实验统计图，与Control组比较，*P<0.05 图1 ALI小鼠AMs中YAP蛋白表达降低Fig.1 Reduced YAP protein expression in AMs of ALI mice

2.2 YAP干扰抑制AMs的吞噬功能

为探究YAP对AMs吞噬功能的影响，我们进行了YAP干扰试验。荧光显微镜观察证明siRNA转入MH-S的效率大于95%(图2A)，转染后YAP总蛋白的表达减少了70%(图2B)，说明RNA干扰有效。YAP干扰组及其对照细胞与FITC标记的E.coli孵育后，流式细胞术检测MH-S吞噬E.coli的情况。结果如图2C，与对照组相比，YAP干扰组MH-S细胞吞噬E.coli的能力明显降低(P<0.01，图2D)。为进一步证明YAP对AMs吞噬功能的影响，我们使用YAP抑制剂Verteporfin抑制YAP活性后观察MH-S细胞吞噬功能的变化。与对照组相比，YAP活性抑制组MH-S吞噬E.coli的能力也明显降低(图2E、2F)，与YAP干扰的结果一致。上述结果说明，无论是YAP活性抑制还是干扰YAP表达，AMs吞噬E.coli的能力均下降。

2.3 AMs吞噬功能降低涉及MARCO受体下降

清道夫受体(scavenger receptor，SR)根据其分子结构和生物学功能可以分为A～J 10个亚类，其中SR-A和SR-B与肺部炎性疾病的关系更为密切[11]。研究表明，SR-A(-/-)小鼠更易受到肺炎支原体的感染，并可通过靶向MARCO受体的表达增强巨噬细胞抵御流感病毒的能力[12]。我们首先观察MARCO阻断抗体对MH-S细胞吞噬E.coli的影响。使用MARCO抗体阻断后，再使用APC-MARCO Ab表面染色MH-S细胞，与正常对照组相比，阻断组MARCO平均荧光强度明显降低(图3A、3B)，说明AMs表面MARCO受体阻断有效。将MH-S细胞先用MARCO Ab阻断后再与FITC标记的E.coli一起孵育，流式检测MH-S细胞吞噬情况，结果表明，与正常对照组相比，MARCO Ab作用组MH-S细胞吞噬能力显著降低(图3C、3D)。上述实验说明AMs吞噬E.coli的作用通过MARCO受体介导。进一步观察YAP对AMs表面MARCO受体表达的影响，发现干扰YAP表达后，MH-S细胞表面MARCO受体表达降低(图3E、3F)。

1：Control；2：Mock；3：Sc siRNA；4：YAP siRNA；A：荧光显微镜检测MH-S细胞转染FAM-Sc siRNA的效率(×200)；B：Western blot检测转染YAP siRNA后MH-S细胞总蛋白中YAP蛋白表达情况，与Sc siRNA组比较，**P<0.01；C、D：流式细胞术检测各组细胞对FITC标记E.coli的吞噬率，代表性流式图(C)和统计图(D)，与Sc siRNA组比较，**P<0.01；E、F：2 μmol/L的Verteporfin(VP)或溶剂DMSO对MH-S细胞吞噬功能的影响，代表性流式图(E)和统计图(F)，与Control组比较，**P<0.01；Control：空白对照组，Mock：转染试剂对照组，Sc siRNA：干扰对照组，YAP siRNA：YAP干扰组图2 干扰YAP表达或抑制其活性对AMs吞噬功能的影响Fig.2 Effect of YAP expression interference or YAP activity inhibition on phagocytosis ability of AMs

3 讨论

ALI是以炎性细胞浸润、低氧血症和肺水肿为特征的急性全身性炎症的肺部表现，属于急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的轻度阶段[4]。引起ALI的诱导因素中，细菌和病毒感染是常见的主要原因[13]。吞噬作用是吞噬细胞经过一系列高度复杂且协调的分子机制与外源性颗粒异物识别、结合、摄取和消化的生物学过程，对清除气道中的病原体，消除炎症至关重要[14]。

YAP是Hippo通路重要的转录共激活因子[15]。应激反应中，YAP能促进肺泡上皮细胞的增殖和分化[16]，也能通过促进伤口愈合和组织再生，缓解细菌所致的肺部炎症[17-18]。YAP信号通路异常与多种肺部疾病相关，如肺癌、肺纤维化、肺动脉高压、COPD、哮喘、肺部感染等[19]。有研究表明，YAP基因敲除小鼠表现出更加严重的炎症反应[20]；而且在LPS诱导的ALI模型中小鼠肺内皮细胞[21]和人脐静脉内皮细胞[22]中YAP的表达也受到抑制。以上的研究表明YAP表达与ALI存在关联，而具体的机制还不清楚。

AMs是气道内的主要免疫细胞，是肺部抵御入侵病原微生物的第一道防线，在受到刺激后会发生极化产生多种细胞因子[23]。TNF-α是由巨噬细胞分泌的细胞因子，其主要功能是调节免疫细胞，引起细胞凋亡、炎症和自身免疫[24]。研究显示，TNF-α刺激小鼠软骨细胞[25]和大鼠肝脏祖细胞[26]后，YAP的表达显著减少。这些研究与本实验中检测ALI小鼠原代AMs中YAP表达和TNF-α刺激MH-S后YAP的表达结果相一致，说明在炎症环境下，无论是体内还是体外AMs中YAP的表达均下降。

A、B：MH-S细胞按照1×105个/孔接种6孔板，加入1 μg/mL的MARCO阻断抗体(MARCO Ab)或者同型抗体(Iso Ab)继续培养6 h，对各组细胞使用APC-MARCO或者同型对照流式抗体进行染色，检测细胞表面MARCO受体的阻断情况，代表性流式图(A)和统计图(B)，与Iso Ab组比较，*P<0.05；C、D：将各组MH-S细胞与FITC-E.coli共同孵育后流式细胞术检测各组细胞吞噬率，代表性流式图(C)和统计图(D)，与空白对照组(Control)比较，*P<0.05；E、F：MH-S细胞转染YAP siRNA及其对照Sc siRNA 48 h后，使用APC-MARCO或者同型对照流式抗体进行染色，流式细胞术检测细胞表面MARCO受体的表达情况，代表性流式图(E)和统计图(F)，与Sc siRNA组比较，**P<0.01；Isotype：同型对照组，Control：空白对照组，Mock：转染试剂对照组，Sc siRNA：干扰对照组，YAP siRNA：YAP干扰组图3 AMs吞噬功能降低涉及MARCO受体表达下降Fig.3 MARCO receptor expression reduction is involved in the phagocytosis ability decline of AMs

吞噬细胞吞噬功能变化会直接影响各种疾病的发生发展，比如阿尔茨海默病患者脑内小胶质细胞的吞噬功能下降会影响患者的生存且预后不佳[27]；吸入氢气可以增强哮喘小鼠AMs吞噬功能以减轻哮喘症状[28]。我们前期的研究结果表明，YAP可以促进气道上皮细胞的吞噬功能[6]。但YAP与AMs这种专职巨噬细胞吞噬功能的关联还不清楚，所以我们采用siRNA干扰YAP表达或以抑制剂抑制YAP活性后检测其吞噬功能，发现其吞噬功能与对照组相比均下降，与上述研究结果相一致。说明YAP活性能影响AMs吞噬功能，而吞噬作用对ALI的发展至关重要，所以探讨YAP对吞噬功能的调控及其机制，对研究ALI的进展有重要意义。清道夫受体参与多种疾病的发生发展，例如动脉粥样硬化[29]、代谢紊乱以及作为调节因子参与宿主抗肿瘤免疫反应等。MARCO是表达于巨噬细胞表面的清道夫受体，属于SR-B家族，其对病原体的清除具有重要作用[30]。当MARCO受体的表达减少时，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬伪足数量明显减少，从而导致吞噬功能下降[31]。本研究将MH-S细胞表面MARCO受体阻断后，发现其吞噬E.coli的能力降低，表明MARCO受体在AMs吞噬E.coli过程中扮演着重要的角色。采用YAP siRNA干扰MH-S细胞后再去检测MARCO受体表达，与对照组相比，YAP干扰组MARCO受体表达明显下降，说明AMs中MARCO受体的表达受到YAP调控。但是当机体受到刺激后，YAP具体是通过何种机制调控AMs表面MARCO受体表达还有待研究。

综上所述，本研究证明ALI小鼠AMs中YAP蛋白表达下降，干扰YAP表达可以导致AMs表面MARCO受体表达降低和吞噬E.coli功能减弱。本研究说明了ALI小鼠AMs吞噬功能降低的可能原因，对探讨专职吞噬细胞其吞噬功能的机制具有重要意义。