HAPLN3基因在肾透明细胞癌中的表达及其与预后、免疫的关系*

张畅，宋具昆，袁东波，陈伟明，何虎，钱城，杨萌，朱建国

（1.贵州医科大学 研究生院，贵州 贵阳 550004；2.贵州省人民医院 泌尿外科，贵州 贵阳 550002）

肾癌起源于肾小管上皮细胞，占成人恶性肿瘤 的2%～3%，其发病率以每年约2.5%的速度上升，2021 年美国新发7 万多例肾癌病例和2万多例死亡病例[1]。肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的组织学类型，占肾癌的80%～90%[2]。不同时期ccRCC 患者生存率差异较大，其中分化差或已有转移的ccRCC 患者总体生存率普遍较低[3]。多项研究报道，1/3 的局限性ccRCC 患者出现术后复发或转移，单纯手术治疗、放疗及化疗效果均不佳[4-5]。欧洲泌尿外科协会临床指南将免疫检查点抑制剂作为晚期转移性ccRCC 的一线治疗[6]。ccRCC 免疫检查点抑制剂主要通过程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）、细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4），维护T 淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤力[7]。

透明质酸和蛋白多糖链接蛋白家族基因成员3（hyaluronan and proteoglycan link protein 3,HAPLN3）分子量为40 894 Da，其编码的蛋白是透明质酸和蛋白多糖链接蛋白基因家族成员，包含360 个氨基酸，在人体各组织中广泛表达，主要存在于细胞外基质。该蛋白具有促进癌细胞迁移、诱导血管化、促进肿瘤生长的作用。而由透明质酸与蛋白多糖组成的细胞外基质，对肿瘤细胞的黏附、迁移、增殖、分化和存活等方面均有影响[8]。

既往研究表明，细胞外基质透明质酸和蛋白多糖在ccRCC 的发展中起重要作用[9]。HAPLN3 作为透明质酸与蛋白多糖的链接蛋白在肾癌中的作用显得尤为重要，然而HAPLN3 与ccRCC 的相关性未见报道。本文通过多个数据库进行分析，探讨HAPLN3 在ccRCC 中的差异表达、预后价值及免疫特征，分析HAPLN3 在ccRCC 中免疫及肿瘤相关通路的富集情况，以及HAPLN3基因表达降低对肾癌细胞株增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 组织标本

癌症基因组图谱分析（the cancer genome atlas,TCGA）（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库下载时间为2021 年5 月，获取530 个ccRCC 患者及72 个癌旁组织标本的RNA 数据和相应的临床信息。由于TCGA 数据库癌旁组织较少，将基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库的正常组织标本加入对照。使用GTEx 数据库（https：//gtexportal.org/home/datasets）V8 版本，下载89 个正常肾脏组织的RNA 数据。mRNA 相对表达量均为标准化处理后的数据，将ccRCC 患者标本设为肿瘤组（530例）。以HAPLN3 mRNA 中位数为截断点，将标本分为高表达组（265例）、低表达组（265例）。按WHO/ISUP分级系统中的G3级、G4级，分为G3组（206例）、G4组（75例）。最后将癌旁组织标本和正常组织标本作为正常组（161例）。临床资料不完整的患者，如pMx 期不能使用，则作为缺失病例处理。

1.2 细胞培养

人肾近曲小管上皮细胞系HK-2、肾透明细胞癌细胞系OS-RC-2、ACHN 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。90%基础培养基+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+1%双抗配制成完全培养基，进行培养、传代，将细胞置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

1.3 主要试剂及仪器

基础培养基、FBS、双抗（美国Gibco 公司），BCA蛋白定量试剂盒、SP 检测试剂盒（北京索莱宝有限公司），放射免疫分析（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人HAPLN3 多抗（北京博奥森生物技术有限公司），β-tubulin 抗体（美国Affinity Biosciences 公司），山羊抗兔IgG-HRP（美国Abeam 公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）Mix 试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司），RNA 试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司），LipofectamineTM2000 试剂盒（美国Invitrogen 公司），CCK-8（日本同仁化学研究所），快速封闭液（英国Genefist 公司），含干扰序列si-HAPLN3 和si-NC 质粒（上海吉凯基因公司）。

二氧化碳细胞培养箱（中国上海力申科学仪器有限公司），凝胶成像系统、qRT-PCR 仪、电泳槽、转膜仪（美国Bio-Rad 公司），酶标仪（美国Bio Tek Instruments 公司）。

1.4 方法

1.4.1 差异表达、生存分析及预后模型构建使用R 软件分析HAPLN3 在肿瘤组与正常组中的mRNA差异表达，并进一步分析在G3 组、G4 组及正常组中mRNA差异表达，“ggplot2”R软件绘制箱线图。“survival”“survminer”R 软件绘制生存曲线，研究不同表达量HAPLN3 对ccRCC 生存率的影响，以及G4 组、G3 组不同亚组间生存差异。采用单变量和多变量Cox 回归分析评估HAPLN3 与5 个主要因素的关系，包括年龄、pT 分期、pN 分期、pTNM 分期、WHO 分级。通过“forestplot”R 软件绘制森林图，显示每个变量的HR、95% CI和P值。使用“rms”R 软件构建列线图，预测1年、3年和5年总体生存率（overall survival,OS），计算出一致性指数（concordance index,C-index），绘制出校正曲线。采用Bootstrap 法自抽样200 次（B=200）验证，C 指数越大，预测价值越高，校正曲线越接近45°斜线，说明预测值与观察值越接近。

1.4.2 免疫细胞浸润及免疫检查点分析采用肿瘤免疫浸润数据库（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER）2.0（https：//cistrome.shinyapps.io/TIMER2.0/）分析HAPLN3 与肿瘤浸润性免疫细胞（tumorinfiltrating immune cells,TIIC）的相关性。采用“immunedeconv”R 软件中的TIMER 2.0 算法分析ccRCC 中HAPLN3 与6 种常见免疫细胞亚型浸润水平的相关性，使用XCELL 算法评估免疫评分、基质评分及肿瘤微环境。使用“ggplot2”“pheatmap”和“immuneeconv”R 软件评估免疫检查点相关基因在G3 组、G4 组的mRNA 相对表达量，以及HAPLN3 与免疫检查点相关基因的共表达情况。使用JIANG等[10]开发的肿瘤免疫功能障碍和排除（tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）算法预测免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade,ICB）疗效，若TIDE 评分高代表接受ICB 治疗后生存期短。

1.4.3 基因富集分析寻找ccRCC 中潜在的HAPLN3 相关信号通路。HAPLN3 表达高表达组和低表达组使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）v3.0（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）。本研究中P＜0.05 和FDR＜5%为差异有统计学意义。

1.4.4 免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）法检测HAPLN3的表达选取2020 年1 月—2021 年8 月在贵州省人民医院泌尿外科行根治性肾切除的50例患者的癌组织和对应的癌旁组织标本。本研究获得医院伦理委员会批准并经患者同意后签署知情同意书。标本进行常规石蜡包埋，切片厚度约4 μm，脱蜡，脱水，抗原修复，封闭，HAPLN3 一抗（1∶2 000）孵育过夜，羊抗兔IgG 二抗（1∶200）37℃孵育30 min，DAB 显色，苏木精复染，脱水，透明封片。显微镜下随机选取5 个视野，由2 位病理科医师独立进行评价。染色强度：无着色为0 分，淡黄色为1 分，黄褐色为2 分，深褐色为3 分。阳性细胞比例：＜5%为0 分；5%～25%为1 分；＞25%～50%为2 分；＞50%～75%为3 分；＞75%为4 分。相乘得出最终结果，0 分为阴性（-），1～4 分为弱阳性（+），5～8 分为阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。根据IHC 染色结果分为阴性表达（阴性和弱阳性）和阳性表达（阳性和强阳性）。

1.4.5 Western blotting检测HAPLN3 蛋白的表达取培养好的细胞，RIPA 裂解，离心后收集上清液。根据BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行操作测定蛋白浓度。配置5%浓缩胶、10%分离胶进行上样电泳和转膜，快速封闭液封闭10 min，稀释β-tubulin、HAPLN3 后4℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次，稀释二抗，室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次，显影，采用Image J软件计算蛋白条带灰度值，进行半定量分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.4.6 qRT-PCR检测HAPLN3 mRNA的表达采用RNA 试剂盒提取细胞RNA，然后在260 nm 波长处测定吸光度值和RNA 浓度，将RNA 逆转录成cDNA。按照qRT-PCR Mix 试剂盒说明书配置20 μL反应体系：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，补充ddH20 至20 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环，熔解曲线按仪器默认条件。以β-actin 为内参，计算HAPLN3 mRNA 相对表达量。HAPLN3正向引物：5'-AGGAGACCCTGTTCACCTACC-3'，反向引物：5'-ACAGCTTCCACCATTTGACAC-3',引 物长 度 111 bp；β -actin正向引物 ：5'-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'，反向引物：5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'，引物长度129 bp。引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.4.7 细胞转染及CCK-8 细胞增殖实验取对数生长期OS-RC-2、ACHN 细胞，根据LipofectamineTM2000 试剂盒说明书，分别转染si-HAPLN3 和si-NC。转染完成后qRT-PCR 检测siRNA 沉默效率。将构建成功的细胞胰酶消化后计数，等密度均匀接种于96 孔板,100 μL/孔，细胞4 000 个/孔,每组设置4 个复孔，分别于0 h、24 h、48 h、72 h 加入CCK-8 试剂，孵育2 h 后用酶标仪测定450 nm 波长处的光密度（optical density,OD），计算各组细胞存活率。

1.5 统计学方法

数据分析采用Rv 4.0.3 和GraphPad Prism v8.02统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数M（P25，P75）表示，比较用秩和检验，进一步两两比较用Dunn'st检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；相关性分析用Spearman 法；影响因素的分析用单因素和多因素Cox风险比例模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HAPLN3 mRNA相对表达量比较及生存分析

肿瘤组与正常组HAPLN3 mRNA 相对表达量分别为3.138（2.541，3.748）和1.565（1.137，2.400），经秩和检验，差异有统计学意义（H=14153.000，P=0.000），肿瘤组高于正常组。

G4 组、G3 组、正常组HAPLN3 mRNA 相对表达量分别为4.081（3.281，4.755）、3.591（2.923，4.182）和1.565（1.137，2.400），经秩和检验，差异有统计学意义（H=208.342，P=0.000）。进一步两两比较结果：G4 组HAPLN3 mRNA 相对表达量高于G3 组、正常组（P＜0.05），G3 组HAPLN3 mRNA 相对表达量高于正常组（P＜0.05）。

生存曲线结果显示，HAPLN3 高表达组与低表达组OS 比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.673，P=0.003），HAPLN3 高表达组OS 低于低表达组，提示HAPLN3基因高表达与ccRCC 患者预后不良有关。G4 组与G3 组OS 比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=33.063，P=0.000），G4 组OS 组低于G3 组，提示高级别ccRCC 可能预后更差。见图1。

图1 各组Kaplan-Meier法绘制生存曲线

2.2 临床特征的单因素和多因素分析

预后模型构建以TCGA 数据库下载的肾癌患者年龄、临床分期、病理分级及HAPLN3 表达为自变量，总生存情况为因变量，通过单因素及多因素Cox回归分析筛选肾癌预后的独立危险因素。单因素Cox 回归分析结果表明，HAPLN3 高表达[=1.548（95%CI：1.325，1.801）]、高龄[=1.029（95%CI：1.016，1.042）]、高pT 分期[=1.923（95%CI：1.632，2.265）]、高pN分期[=3.425（95% CI：1.818，6.456）]、高pTNM分期[=1.867（95% CI：1.638，12.12）]、高Grade分级[=2.291（95% CI：1.870，2.806）] 是ccRCC 患者不良预后的影响因素（均P=0.000）。

列线图结果表明，用HAPLN3 表达量、年龄、pTNM 分期、Grade 分级构建的预后模型可以较好地预测ccRCC 患者的1 年、3 年、5 年OS，C 指数为0.779（95%CI：0.729，1.000）（P=0.000）。见图2。

图2 HAPLN3联合相关临床特征构建的列线图及校正曲线

2.3 HAPLN3 mRNA 相对表达量与免疫细胞亚型浸润水平的相关性

HAPLN3 mRNA 相对表达量与B 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润呈正相关（rs=0.284、0.532、0.584、0.617、0.323 和0.620，均P=0.000），提 示HAPLN3 可能参与多种ccRCC 免疫细胞浸润调节。见图3。

图3 HAPLN3 mRNA相对表达量与免疫细胞亚型浸润水平的相关性

2.4 HAPLN3 与免疫相关基因共表达分析及ccRCC免疫检查点分析

G4组与G3 组CD274、HAVCR2、PDCD1LG2、SIGLEC15 mRNA 相对表达量比较，经Wilcoxon 检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。G4 组与G3 组CTLA4、LAG3、PDCD1、TIGIT mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），G4 组高于G3 组，提示高级别ccRCC 更易形成免疫逃逸。见图4、5 和表1。

表1 两组疫检查点相关基因mRNA相对表达量比较 [M（P25，P75）]

图4 两组免疫检查点相关基因mRNA相对表达量比较

图5 两组免疫检查点分析及免疫检查点ICB治疗TIDE评分

通过TIDE 算法得出G4 组、G3 组TIDE 评分分别为0.805（-0.148，1.385）分和0.260（-0.495，1.170）分，经Wilcoxon 检验，差异有统计学意义（Z=-2.482，P=0.013），G4 组高于G3 组，提示高级别ccRCC 患者行ICB 治疗效果更差。免疫抑制基因共表达分析结果表明，几乎所有免疫抑制基因也都与HAPLN3阳性共表达，上述结果提示HAPLN3可能是G4 组ccRCC潜在的免疫治疗靶点。见图6。

图6 HAPLN3与免疫抑制基因共表达情况

2.5 基于GSEA数据库完善ccRCC中HAPLN3通路富集分析

HAPLN3 高表达在多个免疫相关通路富集，包括细胞因子受体相互作用，NK 细胞介导的细胞毒性通路、趋化因子信号通路、JAK-STAT 信号通路、黏附分子Cam、T 细胞受体（T cell receptor,TCR）信号通路、B 细胞受体（B cell receptor,BCR）信号通路、MAPK 信号通路、Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）信号通路、Notch 信号通路、Wnt 信号通路等。这些信号通路的发现表明HAPLN3 可能参与ccRCC的免疫相关通路，而TCR 信号通路尤其值得关注。见表2。

表2 HAPLN3在ccRCC相关通路富集分析

2.6 癌组织与癌旁组织HAPLN3蛋白的表达

HAPLN3 主要定位于细胞质，呈棕黄色（见图7）。癌组织、癌旁组织HAPLN3 阳性表达率分别为58%（29/50）和36%（18/50），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.857，P=0.028），癌组织HAPLN3 阳性表达率高于癌旁组织。

2.7 HK-2、OSRC-2、ACHN细胞 HAPLN3 mRNA和蛋白相对表达量比较

HK-2、OSRC-2、ACHN细胞HAPLN3 mRNA 相对表达量分别 为（1.00±0.11）、（1.30±0.08）和（1.75±0.13），经方差分析，差异有统计学意义（F=33.930，P=0.000）；OSRC-2、ACHN细胞HAPLN3 mRNA 相对表达量高于HK-2 细胞（P＜0.05）。

HK-2、OSRC-2、ACHN 细胞HAPLN3 蛋白相对表达量为（1.00±0.18）、（2.84±0.11）和（4.02±0.21），经方差分析，差异有统计学意义（F=235.3，P=0.000）；OSRC-2、ACHN 细胞HAPLN 蛋白相对表达量高于HK-2 细胞（P＜0.05）。见图8。

图8 HK-2、OSRC-2、ACHN细胞HAPLN3蛋白的表达

2.8 沉默HAPLN3对肾透明细胞癌增殖的影响

si-NC 组、si-HAPLN3 组OS-RC-2 细胞HAPLN3 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.12）和（0.42±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=6.601，P=0.002），si-HAPLN3 组低于si-NC 组，说明细胞转染成功。

si-NC 组、si-HAPLN3 组ACHN细胞HAPLN3 mRNA 相对表达量分别为（1.00±0.14）和（0.44±0.08），经t检验，差异有统计学意义（t=5.847，P=0.004），si-HAPLN3 组低于si-NC 组，说明细胞转染成功。

si-NC 组、si-HAPLN3 组不同时间点OS-RC-2、ACHN 细胞的OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点OS-RC-2、ACHN 细胞的OD 值有差异（F=481.158 和292.321，均P=0.000）；②两组OS-RC-2、ACHN 细胞的OD 值有差异（F=27.471 和255.219，均P=0.002）；③两组OS-RC-2、ACHN 细胞的OD 值变化趋势有差异（F=20.799 和11.301，P=0.017 和0.040）。见表3。

表3 两组不同时间点OS-RC-2、ACHN细胞的OD值比较（）

表3 两组不同时间点OS-RC-2、ACHN细胞的OD值比较（）

注：†与si-NC组比较，P＜0.05。

3 讨论

HAPLN3 作为透明质酸和蛋白多糖链接蛋白基因家族成员，是乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤等多种肿瘤的预后标志物[11-13]。尽管目前还没有研究报道HAPLN3 表达与ccRCC 的相关性，但多项文献证实透明质酸和蛋白多糖在不同程度上影响ccRCC 的进展、转移及预后[14]，所以HAPLN3 在ccRCC 中的表达及其作用值得探究。

基于TCGA 数据库，笔者发现HAPLN3 在ccRCC中的表达高于正常肾脏。其结果在组织水平经IHC染色验证，在细胞水平经qRT-PCR 和Western blotting 实验验证，并通过CCK-8 法进一步验证沉默HAPLN3的ccRCC 细胞增殖能力下降，提示该基因可能与ccRCC 增殖有关。随后笔者通过TCGA 数据库分析HAPLN3 在不同WHO 分级亚组的表达，发现WHO 分级G4 组高于G3 组，提示HAPLN3 表达上调可能导致ccRCC 向更差的组织学分级进展，遗憾的是本实验未收集到G4 组标本，后期需加大病例数验证不同组织学分级间HAPLN3 的表达。生存分析结果表明，HAPLN3 高表达较低表达ccRCC 患者的OS低，提示HAPLN3 可能与ccRCC 患者预后不良有关。通过单因素和多因素Cox 回归分析发现HAPLN3、年龄、pTNM、Grade 分级是ccRCC 患者不良预后的独立影响因素。

免疫靶向治疗逐渐成为晚期肾癌新的治疗方式[15]，且细胞外基质与免疫微环境关系密切[16]，故选用TIMER 2.0 数据库来研究HAPLN3 表达与免疫细胞的相关性，结果表明HAPLN3 mRNA 相对表达量与B 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润呈正相关，提示HAPLN3 可能参与ccRCC 免疫细胞浸润调节。进一步分析发现HAPLN3与多种免疫检查点呈阳性共表达，包括CTLA4、LAG3、PDCD1 和TIGIT，这些免疫检查点在近年来是晚期ccRCC 的新兴治疗研究热点[17]，故后续探究HAPLN3与明星免疫检查点的关系很有意义。结合HAPLN3 在ccRCC 不同WHO 分级中的差异表达、免疫检查点分析及TIDE 评分，笔者猜测HAPLN3 表达上调影响免疫抑制基因的功能，从而造成组织学分级较差的ccRCC 不能在ICB治疗中获得较好的疗效，提示HAPLN3 可能成为高级别ccRCC 潜在的免疫治疗靶点，以及成为ICB 治疗的预测指标。

GSEA 数据库分析结果显示，HAPLN3 在ccRCC中与TCR 信号通路、BCR 信号通路、NK 细胞介导的细胞毒性通路、TLR 信号通路等免疫相关信号通路富集。KRISHNA等[18]单细胞测序TCR 轨迹分析结果表明，ICB 治疗在有反应与耐药患者之间存在不同的T 淋巴细胞分化途径，然而暂无BCR 与肾癌进展的相关研究。有研究表明，ccRCC 中有NK 细胞浸润，但是随着肿瘤进展，可能出现功能障碍[19]。TLR是连接非特异性免疫与特异性免疫的桥梁。MORIKAWA等[20]研究表明，TLR3 在ccRCC中过表达，TLR3 通路可能代表CCRCC 新的治疗靶点。另外本研究结果表明，HAPLN3基因在细胞因子受体相互作用信号通路、趋化因子信号通路、JAK-STAT信号通路、黏附分子Cam 信号通路、MAPK 信号通路、Notch 信号通路、Wnt 信号通路等癌症相关通路富集。

本研究结果表明，HAPLN3基因在ccRCC 细胞中高表达，且与肿瘤细胞增殖有关，通过该基因构建的临床预后模型可较好地预测患者1 年、3 年和5 年总生存率。HAPLN3基因在ccRCC 中与免疫细胞浸润、免疫相关检查点存在相关性，并且可能通过多种肿瘤免疫机制促进ccRCC 的发生、发展。HAPLN3 有作为ccRCC 免疫治疗靶点的潜在价值。