阿尔茨海默病与microRNA-206基因多态性的关系

李俊彦 余梦擎 杨琳琳 蔡钰莹 李友 杨宇

广东医科大学附属医院1老年医学科，2急诊医学中心，3神经病学研究所（广东 湛江 524000）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种主要引起痴呆的神经退行性疾病，其特征是进行性记忆力下降，常伴有执行、语言和（或）视觉空间功能的缺陷以及行为改变，严重者导致死亡[1-2]。AD是一种缓慢且不可逆的，但进行性、复杂和多因素的神经系统退行性疾病，是老年人群痴呆的最常见原因。65岁后患AD的风险显著增加，超过85岁的人群患AD的风险高达30%[3-4]。

目前，AD的病因尚未完全明确。神经炎症、细胞外以β淀粉样蛋白为主要蛋白组分的老年斑和细胞内神经原纤维缠结是AD的关键病理标志物。AD主要特征是皮质和海马神经元丢失，以及关键神经递质通路的进行性退化[5-6]。MicroRNAs是0生物体内源性的小RNA分子，长度为19～23个碱基对。大量研究发现microRNAs在中枢神经系统中的含量非常丰富，它们在神经细胞的增殖、发育、分化、凋亡，神经元迁移及突触塑形过程中扮演了非常重要的角色，从而参与多种神经系统疾病的发生[7-9]。LEE等[10]报道了AD患者颞叶皮层的脑组织microRNA-206表达水平明显升高。国内学者林晓光[11]研究发现microRNA-206通过调节脑源性神经营养因子（BDNF）及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路，促进神经元凋亡，进而参与AD的发病。

编码人microRNA-206基因位于6号染色体短臂1区2带（6p12），含有1个外显子[12-13]。WANG等[14]研究发现microRNA-206基因上游启动子区域rs16882131位点多态性与BDNF基因rs6265位点多态性存在密切的交互作用，这种交互作用会增加双相情感障碍发病风险。基于上述研究，我们推测microRNA-206基因rs16882131位点多态性可能与AD的发病有关。迄今为止，从分子遗传学角度研究microRNA-206基因多态性与AD易感性的关系尚没有国内外文献报道。本研究以中国人群为对象，首次分析microRNA-206基因rs16882131位点多态性与AD易感性的关系，并比较AD患者与健康者外周血microRNA-206表达水平的变化，进一步探讨rs16882131位点不同基因型与microRNA-206表达水平的关系。这为阐明microRNA-206基因多态性与AD易感性的关系提供强有力的依据，为AD的诊治提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 研究对象以2017年1月至2021年6月在广东医科大学附属医院老年医学科门诊或住院的100例AD患者（病例组）为研究对象。AD的诊断参照1984年美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会（National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke/Alzheimer Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA）制定的标准[15]并且符合2011年美国国立老化研究所和阿尔茨海默协会对此标准进行修订的“很可能的AD”的核心临床标准。病例组排除标准：（1）其他类型的痴呆。（2）既往有精神障碍性疾病。（3）既往有影响神经系统功能的疾病者，如自身免疫性脑炎等。对照组选自广东医科大学附属医院体检中心同期体检的健康者100例。对照组排除标准：（1）简易精神状态量表（MMSE）评分＜ 28分。（2）认知能力和日常生活能力下降。（3）有痴呆家族史或中枢神经系统疾病史者。（4）既往有精神障碍性疾病。两组研究对象均为无血缘关系的中国人群。本研究已通过广东医科大学附属医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。两组的一般临床资料详见表1。

表1 两组一般临床资料比较Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

表1 两组一般临床资料比较Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

临床资料年龄（岁）性别（男/女，例）吸烟史（例）受教育年限（年）MMSE评分病例组（n=100）68.36±9.34 43/57 36 9.51±1.42 11.95±2.35对照组（n=100）67.58±9.15 46/54 33 9.62±1.45 28.27±2.56 t/χ2值0.597 0.182 0.199 0.542 46.96 P值0.552 0.669 0.655 0.588＜0.001

1.2 基因型检测采用乙二胺四乙酸钠抗凝管收集两组研究对象空腹外周静脉血2 mL，按照北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取两组研究对象外周血全基因组DNA。运用SNaPshot技术[16]对两组研究对象的microRNA-206基因rs16882131位点进行基因型检测，主要操作步骤包括：多重聚合酶链反应（PCR）、单碱基延伸反应以和多态性位点的测定。其中rs16882131位点PCR上游引物序列：5'-ATGCACAAAAACAGCAGCAG-3'；下游引物序列：5'-GAAAAACCTTTGGGGGAAAG-3'。

1.3 外周血单个核细胞总microRNA提取和实时荧光定量PCR采用密度梯度离心法提取两组研究对象外周血单个核细胞，并根据RNA提取试剂盒操作步骤提取单个核细胞总microRNA。按照cDNA反转录试剂盒操作说明书将单个核细胞总microRNA反转录为cDNA。根据荧光定量试剂盒和实时荧光定量PCR仪操作步骤检测两组研究对象microRNA-206的表达水平，以U6作为microRNA-206内参定量产物浓度。每个cDNA样本重复检测3次实时荧光定量PCR，运用2-ΔΔCt值计算两组研究对象microRNA-206的相对表达量。

1.4 统计学方法采用直接计数法统计两组的基因型频率和等位基因频率；采用哈迪-温伯格定律对两组进行遗传平衡吻合度检验；两组基因型频率和等位基因频率分布的比较采用χ2检验。计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验。本研究数据运用SPSS 19.0软件分析，均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组microRNA-206基因rs16882131位点的基因型频率和等位基因频率分布比较病例组和对照组的microRNA-206基因rs16882131位点的基因型频率分布均符合哈迪-温伯格定律（P＞0.05），提示两组纳入的研究对象具有良好的群体代表性。病例组microRNA-206基因rs16882131位点的CC、CT和TT基因型频率分别是44.0%、38.0%和18.0%，对照组分别是59.0%、34.0%和7.0%，两组基因型频率比较差异有统计学意义（CCvs.CTvs.TT：P=0.027；显性模型TT+CTvs.CC：P=0.034，OR=1.831，95%CI：1.045 ～ 3.209）；病例组microRNA-206基因rs16882131位点T等位基因频率明显高于对照组（37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860，95%CI：1.206 ～ 2.868），见表2。

表2 两组microRNA-206基因rs16882131位点基因型和等位基因频率分布比较Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs16882131 in the microRNA-206 gene between the two groups 例（%）

2.2 两组外周血microRNA-206表达水平的比较和rs16882131位点对microRNA-206表达水平的影响病例组的microRNA-206相对表达量明显高于对照组[（1.85± 0.24）vs.（0.99± 0.18）]，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。对照组rs16882131位点的基因型与microRNA-206表达水平的关系分析发现TT+CT基因型（T等位基因携带）的microRNA-206相对表达量明显高于CC基因型[（1.33±0.19）vs.（0.75±0.17）]，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

3 讨论

AD是一种进行性且不可逆的神经系统退行性疾病，是老年人中最常见的痴呆形式。AD可分为3个阶段：（1）临床前期，通常没有出现临床症状，有生物学标志物的早期改变。（2）前驱期，包括疾病的最早症状阶段，即认知能力下降开始明显，而生物标志物水平未达到诊断痴呆的截止标准。（3）病理和症状学完全发展的痴呆阶段。目前认为AD主要的病理基础是淀粉蛋白前体蛋白异常断裂、β淀粉蛋白沉积和神经纤维缠结[17-19]。

β淀粉蛋白沉积和微管相关蛋白过度磷酸化是AD早期神经退行性过程的关键致病因素，并且它们被认为在突触处局部相互作用，导致突触功能障碍和认知减退。越来越多的证据表明突触中蛋白质功能的改变可能参与AD的早期突触改变[20-22]。近年来，一些研究发现MicroRNAs可能通过改变突触的结构和功能从而导致神经退行性变[23-24]。众所周知，BDNF是中枢神经系统中表达最广泛的神经营养因子系统，它通过与其特异性受体酪氨酸受体激酶B6结合而对神经元产生神经营养作用。此外，BDNF是参与维持突触可塑性和突触发生的关键分子。有研究发现过表达microRNA-206会抑制BDNF的生成，进一步引起突触功能障碍和神经退行性变，进而参与AD的发病。由此可见，microRNA-206的异常表达与AD发病密切相关。基于此，本研究首次分析microRNA-206基因rs16882131位点多态性与AD易感性的关系，并比较AD患者与健康者外周血microRNA-206表达水平的变化。

本研究发现AD患者microRNA-206基因rs16882131位点TT+CT基因型（T等位基因携带）和T等位基因频率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（56.0%vs.41.0%，P=0.034，OR=1.831；37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860），提示T等位基因可能是AD易感性的危险因素。此外，AD患者外周血microRNA-206表达水平明显高于对照组。基于这些发现，推断microRNA-206基因多态性与AD易感性密切相关，并且外周血microRNA-206可作为AD的一种重要的生物学标记物。值得一提的是，本研究还发现rs16882131位点T等位基因携带者的microRNA-206表达水平明显高于CC基因型。rs16882131位点位于microRNA-206基因上游启动子区域，推测microRNA-206基因rs16882131位点T等位基因可能增加其启动子区转录活性，引起microRNA-206基因表达上调，进而参与AD的发病。然而，rs16882131位点多态性与microRNA-206基因启动子区转录活性的关系需要更进一步的基础研究去证实，这也是继续开展研究的方向之一。

本研究尚存在一些不足地方。首先，本研究纳入的总体研究对象样本量相对偏小。其次，本研究只分析了microRNA-206基因rs16882131位点多态性与AD易感性的关系。因此，后续研究将会继续增加病例对照组样本量，更进一步分析microRNA-206基因其余位点多态性与AD易感性的关系。此外，在后续的研究中我们将会继续寻找其他参与AD发病的基因，进一步分析其多态性与不同人群AD易感性的关系。

综上所述，microRNA-206基因rs16882131位点多态性与AD发病易感性有关，T等位基因可能通过上调microRNA-206的表达进而引起AD。