不同供氮水平的核桃幼苗生长及叶绿素荧光特性

黄小辉，吴焦焦，王玉书，冯大兰，孙向阳

(1.北京林业大学林学院，北京 100083；2.三峡库区森林生态保护与恢复重庆市市级重点实验室，重庆 400036；3.四川农业大学林学院，四川 成都 611130)

核桃(Juglansregia)与扁桃、腰果、榛子在国际市场上并列为四大干果，也是我国四大木本油料作物之一，具有很高的营养和保健价值。近年来，我国为大力增加健康优质食用植物油供给，切实维护国家粮油安全，相继出台了一系列指导性文件和政策，迅速促进了以核桃为主的木本油料作物产业的发展，全国核桃栽培面积已达330万hm2，位居世界之首[1]。然而，随着核桃种植规模的扩大，大面积果园管理不到位，尤其缺乏科学施肥，导致土壤结构性变差、养分贫瘠且不平衡，常因缺乏某种营养元素而造成树体生长发育不良，果实产量和品质下降，难以获得预期经济效益，严重制约了核桃产业的发展[2]。

氮素是植物生长需求最多的营养元素，也是影响核桃出仁率、核仁脂肪含量和蛋白质含量的主要因子[3]。樊卫国等[4]通过研究氮素形态及配比对铁核桃苗生长及营养吸收的影响，发现单一供应氮素的苗木矮小纤细，须根短，生物量和各种元素的含量及积累量都较少，虽然氮肥充足，但核桃苗木并不能更好地吸收营养供其生长。王益明等[5]发现美国山核桃幼苗的株高、地径和生物量随施氮量增加而先增后减。同样，宋岩等[6]研究表明核桃苗木的株高、根系总体积和净光合速率随施氮水平增加而上升，但当施肥达到一定量后，这些生长指标随着氮水平递增而下降。总体看来，目前有关氮素对核桃的影响研究主要集中在氮肥的种类和施用量对核桃生长生理效应方面。而氮素施用水平过低，核桃苗木吸收营养受限造成的植株生长缓慢和果实品质下降更值得关注。

有学者认为，研究低氮条件下作物对氮素的吸收利用，通过氮胁迫挖掘作物在低氮条件下的生长情况和耐性，提高作物在低氮条件下的生长机能，是解决土壤氮素供应不足的有效方法[7-8]。氮素参与植物光合与呼吸作用、蛋白质合成以及脂肪代谢等重要生理活动[9-10]。尤其是光合作用，作为植物所有物质代谢的基础，受生长环境影响较大，对土壤氮素丰缺十分敏感[11-12]。植物叶绿素荧光分析是近年发展起来的用于光合作用机制研究和光合生理状况检测的有效技术，与一些“表现性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数具有反映逆境胁迫下光系统对光能吸收、传递和耗散等“内在性”特点，因而被视为研究植物光合作用与环境关系的内在探针[13]。因此，笔者以核桃幼苗为研究对象，考察缺氮胁迫对核桃幼苗生长及叶绿素荧光特性的影响，探讨核桃在缺氮胁迫下的适应性及其机制，以期为核桃施肥管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

供试材料为实生核桃苗，品种为‘渝城1号’，来自重庆市渝鲁林业发展有限公司。2018年11月下旬，在重庆市林业科学研究院温室大棚内，将核桃种子进行沙藏。2019年2月上旬播种于装有基质(草炭、黄心土、珍珠岩质量比为5∶4∶1)的育苗床中，常规管理。2019年4月上旬，选择健康、长势一致的幼苗(苗高20 cm、地径3 mm左右)，用去离子水冲洗干净，定植于装有干净石英砂的陶瓷盆中(高20 cm、口径18 cm，每盆装砂5 kg)，共90株。移栽后，缓苗15 d，仅进行常规水分管理。然后随机分为3组，每30盆1组，每组参照霍格兰营养液设置不同供氮处理：对照(CK)，全素营养液；中度缺氮(MN)，氮含量为全素营养液中氮的50%；重度缺氮(SN)，氮含量为0。具体各处理营养方案见表1。培养期间，采用常规水分管理，各处理营养液的施用量根据前期预实验总结而来，每隔5 d用喷壶定量向根部均匀浇灌营养液，每次每盆100 mL。每隔15 d测定苗木相关生长及生理指标。

试验期间每日观察各处理核桃幼苗外观变化，出现缺素症状及时记录并用数码相机拍照，主要拍摄出现症状的植株和叶片。

图1 不同供氮水平下核桃幼苗的外观特征Fig.1 Appearance characteristics of walnut seedling under different nitrogen supply levels

1.2 生长及光合指标测定

1.2.1 生长指标的测定

各处理随机抽取5株(即5个重复，下同)进行核桃幼苗生长指标的测定，包括生物量、叶片厚度、叶面积和根系表面积。采用烘干法测定生物量，将地上部分和根系分开，去离子水洗净后，分别在80 ℃烘箱烘至质量恒定，用万分之一电子天平测定其干质量，根系生物量与地上部分生物量的比即为根冠比；采用精度0.02 mm的游标卡尺测定叶片厚度；采用加拿大WinRHIZO根系分析系统测定根系表面积和叶面积。

1.2.2 光合色素含量的测定

采用丙酮乙醇提取法(丙酮、乙醇、水的质量比为4∶5∶1)测定叶片光合色素含量。选择倒数第3～4片成熟叶，每个样品称取0.1 g，加入10 mL混合液浸提24 h，得到的浸提液分别在470、645、663 nm波长下比色，计算出叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)的含量。

1.2.3 光合参数的测定

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel进行数据统计和图表制作，用SPSS 20.0统计软件进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同供氮水平下核桃幼苗的形态特征

处理后期(60～75 d)各处理核桃幼苗的外观表现见图1。由图1可见，在CK处理(全素营养液)下，植株生长正常，抽梢较长，叶片较大且厚实平滑，叶脉清晰，叶色深绿。在MN处理(中度缺氮)下，前期叶片呈正常绿色，但整个植株和叶片生长明显较CK处理变缓，30 d后，下部老叶开始轻微发黄，至试验后期，整个植株长势明显弱于CK处理，且多数老叶呈淡黄色。在SN处理(重度缺氮)下，核桃的缺氮症状最为明显，15 d后就表现为叶片小，叶脉淡出，下部老叶开始轻微发黄。至试验后期，整株叶片明显黄化，部分叶片边缘甚至出现焦黄现象，整个植株矮小，生长受到明显的影响，长势显著弱于CK和MN处理。

2.2 不同供氮水平下核桃幼苗地上部分生长情况

在低氮处理下，核桃幼苗地上部分生物量、叶面积和叶片厚度相较于正常供氮的CK处理显著下降，且随着缺氮程度的加重下降更明显(表2)。核桃幼苗受到缺氮胁迫后仍能继续生长，但长势相比于CK处理显著下降，尤其在处理后期(45～75 d)更为明显。处理后期(第75天)，MN处理和SN处理的地上部分生物量分别比CK低41.2%和69.2%，叶面积分别比CK低17.9%和40.6%，叶片厚度分别比CK低28.6%和38.1%，均差异显著(P<0.05)。

表2 不同供氮水平下核桃幼苗地上部分生物量、叶面积和叶片厚度(平均值±标准误)Table 2 The above-ground biomass,leaf area and leaf thickness of walnut seedlings under different nitrogen levels(mean±SE)

2.3 不同供氮水平下核桃幼苗根系生长情况

在低氮处理下，核桃幼苗根系生物量和根系表面积相较于正常供氮的CK处理显著下降，且随着缺氮程度的加重下降更明显(表3)。随着处理时间的延长，核桃幼苗受到缺氮胁迫的影响也越明显，地下部分的长势显著弱于CK处理。但总体上，低氮处理下的核桃幼苗根系生长仍强于地上部分，根冠比随着缺氮胁迫的加重而升高，且在处理后期(45～75 d)更为明显。试验结束时(第75天)，MN处理和SN处理的根冠比分别比CK高出39.2%和105.1%，且差异显著(P<0.05)。

2.4 不同供氮水平下核桃幼苗光合色素含量

在低氮处理下，核桃幼苗叶片光合色素总量相较于正常供氮的CK处理显著下降，且随着缺氮程度的加重下降更明显，包括叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素均呈相似的变化趋势(表4)。随着处理时间的延长，各类光合色素含量受缺氮胁迫的影响更明显，尤其在后期，各处理叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量总体均以SN处理最低，其次为MN，CK处理最高。实验结束时(第75天)，MN处理和SN处理的光合色素总量分别比CK低26.5%和50.6%，且差异显著(P<0.05)。

图2 不同供氮水平下核桃幼苗叶绿素荧光参数(平均值±标准误)Fig.2 Chlorophyll fluorescence parameters of walnut trees under different nitrogen levels(mean±SE)

2.5 不同供氮水平下核桃幼苗叶绿素荧光参数

2.6 不同指标的相关性分析

表5 核桃幼苗不同指标的相关性分析Table 5 Correlation coefficients among mulberry tree indexes

3 讨 论

氮素是影响植物生长发育的首要矿质元素，过多或过少施用均会引起植物不正常生长。根系能主动对变化的环境因子做出积极响应，同时又是吸收营养物质和合成植物激素的重要场所，其生长状况直接决定了自身对环境的适应性，并影响氮素吸收、地上部生长和干物质积累[14]。本研究发现，核桃幼苗根系表面积和生物量随缺氮程度的增加及胁迫时间的延长下降更明显，地上部分的生长变化亦是如此。虽然低氮供应下核桃根系生长受到明显影响，但其根冠比显著提高，长势明显强于地上部分。可见，一方面缺氮会抑制核桃根系生长，阻碍营养物质的吸收利用[15]，进而影响地上部分的生长，这与宋岩等[6]对低施氮水平下核桃生长的研究结果一致，均出现如植株矮小、叶片黄化、叶面积和叶片厚度降低、光合作用减弱等现象，其中很大原因是缺氮限制多种物质的合成，影响细胞分裂和伸长，导致植株矮小瘦弱、叶色变淡，降低产量和品质[16]；另一方面，核桃在受到缺氮胁迫后，能够加大对根部的物质投入，这也是植物在胁迫条件下产生的适应性表现，但相对于正常供氮，缺氮仍会影响核桃的生长，尤其在处理后期(45～75 d)表现更明显，这也意味着低氮环境下核桃幼苗的根系和叶片没有形成特定的适应性，长期缺氮条件下必然会引起植株的干枯死亡现象。

叶绿素是植物进行光合作用吸收和传递光能的主要物质，其含量的高低直接决定植物光合作用的强弱，而氮素是叶绿素合成的重要组成部分，缺氮会导致叶绿素含量显著下降，叶片出现变黄的症状[17-18]。本研究同样发现，低氮处理下核桃幼苗的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著下降，且随缺氮程度的加剧下降更明显。这也与朱超等[19]的研究结果相似，即低氮条件下核桃叶片的叶绿素含量和净光合速率均明显比高氮条件下低，同时也表明叶绿素含量可以表示植物对光能的利用能力[20]。并且，随着胁迫时间的延长，核桃叶绿素含量持续下降。综合来看，缺氮对植物根系形态构建和生理代谢造成了不利影响，容易引起生理代谢减弱，而根系长势的下降还会抑制水分和养分在植物中的运输，阻断光合色素合成的物质来源，长时间缺氮还可能造成叶绿体光合机能破坏，进一步抑制叶绿素合成[21-22]。另外，叶面积和叶片厚度能直接反映叶片形态，本研究发现缺氮处理下核桃幼苗叶绿素a含量与叶面积和叶片厚度呈显著正相关，说明核桃幼苗因为缺氮对氮素吸收和同化数量减少，阻碍了核桃幼苗生长，叶面积和叶片厚度减小，叶片形态结构发生明显变化，同时加速叶片衰老和叶绿素含量降低，进而会影响叶片对光能的吸收利用[23-24]。

总之，缺氮会抑制核桃幼苗对氮素的同化和吸收，阻碍根系生长，影响对营养物质的吸收利用，导致植株矮小瘦弱、叶片变小和叶色变淡。同时，缺氮引起核桃叶片光合色素含量下降，造成叶绿体的吸光能力减弱，影响光合电子传递速率和光能利用效率，尤其在长时间光能捕获量不足的情况下，核桃难以通过调整自身光合机制来改善光系统对光能的传递和利用效率，无法实现吸收光能的利用最大化，进而限制叶片光合速率，影响植株生长。