临床异种器官移植十大问题的思考

窦科峰 张玄

20世纪初，由于人们对移植排斥反应的认知不足，以及缺乏有效的免疫抑制剂，关于异种器官移植的尝试均以失败告终[1]。直到1964年，美国Keith Reemtsma给1例肾衰竭患者移植了黑猩猩的肾脏，并给予硫唑嘌呤、糖皮质激素、全身照射等免疫抑制治疗，患者术后顺利康复并重返教师岗位，最终存活9个月，死于突发的电解质紊乱[2]。1984年，美国Leonard Bailey为刚出生12 d，患左心发育不全综合征的女婴移植了1颗狒狒的心脏，术后患儿血液学检查、超声心动图和免疫学监测各项指标均正常，但术后11 d开始出现呼吸急促以及明显心肌损伤，最终因移植排斥反应仅存活21 d[3]。1992年，美国Thomas Starzl将狒狒的肝脏移植给了1例急性暴发性肝衰竭患者，患者最终存活70 d后死于复合性感染[4]。此后的很长一段时间里，异种器官移植始终停留在以猪为供体的临床前研究阶段。

近年来，得益于基因编辑领域的技术突破和新型共刺激信号阻断免疫抑制剂的研发，异种器官移植领域取得了许多突破性进展[5]。2018年，德国Reichart团队完成了异种原位心脏移植临床前试验，受体狒狒存活195 d[6]。2019年，美国Kim等[7]实施猪至恒河猴的原位肾移植，受体猴最长存活499 d。2021年，异种肾移植进入亚临床试验阶段，美国Montgomery团队将猪肾移植给了1例脑死亡患者，术后移植肾功能良好，没有出现排斥反应[8]。2022年，美国Griffith团队成功将基因编辑猪的心脏原位移植给了1例57岁心力衰竭患者，完成了世界首例基因编辑猪到人的心脏移植[9]。这一系列具有里程碑意义的科学事件，为异种器官移植的临床应用带来了希望。那么对于临床异种器官移植，有哪些问题需要我们重点关注，并进一步去攻克呢？

1 临床异种器官移植需克服排斥反应

异种器官移植排斥反应包括：（1） 超急性排斥反应，由猪内皮细胞表面α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）抗原与灵长类动物体内预存抗体结合而诱发，导致补体系统激活，形成膜攻击复合物，随着2002年α-1，3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除猪的问世，超急性排斥反应已经在很大程度上得到解决；（2）急性血管性排斥反应，由非αGal抗原（如Neu5Gc、Sda）与灵长类动物体内抗体结合，引起移植物血管内皮活化和发生单核细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞参与的炎症反应；（3）急性排斥反应，由CD4+T细胞、CD8+细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）参与的急性移植物血管炎和间质炎；（4）慢性排斥反应，由循环中特异性抗体低水平的免疫应答导致血管周围炎症，导致移植物血管内皮持续低程度的损害伴有血管平滑肌细胞增生阻塞血管，移植物功能逐渐下降。研究发现，尽管移植方案不同，但非人灵长类动物的同种肾移植1、3、12个月的生存率明显高于异种肾移植，且病理学观察发现，同种肾移植存在更多的细胞性排斥反应，而异种肾移植则表现出更多的体液性排斥反应[10]。异种器官移植现阶段最难克服的是非αGal抗原参与的急性血管性排斥反应。有学者提出除了敲除3种主要异种抗原基因（αGal、Neu5Gc、Sda）以外，第4种未知异种抗原基因也需要被鉴定和敲除，以期进一步减少体液性排斥反应，改善移植物功能[11]。

2 临床异种器官移植需控制炎症反应

越来越多的证据表明，猪到非人灵长类动物器官移植后会存在持续的全身性炎症反应状态[12]。在移植受体血清中可检测到C-反应蛋白、抗组蛋白抗体、血清淀粉样蛋白A、D-二聚体、细胞因子、趋化因子等多种炎症标志物增加，以及游离三碘甲状腺原氨酸减少。尽管炎症反应在异种器官移植中的作用目前尚不完全清楚，但研究表明，炎症、凝血和免疫反应之间存在着复杂的相互作用[13]，炎症反应可促进凝血途径的激活和适应性免疫反应的发生[14-15]。C-反应蛋白被发现在消耗性凝血疾病或T细胞反应发展之前就会升高[14]。浸润的固有免疫细胞表达组织因子，在启动凝血过程中起重要作用[16]。炎症反应还会抑制T细胞耐受的形成[13]。因此，要延长异种器官移植受体的存活时间，需采取更有效的抗炎策略，包括在基因编辑猪中转入人源化抗炎基因，以及对移植受体给予一定剂量的抗炎药物治疗等。此外，炎症反应的有效控制也可能帮助降低外源性免疫抑制治疗的强度，减轻药物不良反应。根据目前的临床前研究结果，若要实现异种移植物的长期存活，炎症反应的控制至关重要。

3 临床异种器官移植需调节凝血紊乱

异种器官移植时，静息态的内皮细胞、单核细胞会暴露于炎症分子而被激活，丧失抗凝和抗血小板能力，并且表达组织因子，而组织因子的暴露或释放会启动凝血级联途径，并经炎症、固有免疫反应途径放大，此时凝血调节蛋白（如组织因子途径抑制物、血栓调节素等）的种间分子不兼容，会导致其抗凝效应减弱。而血小板一旦接触到血栓表面就会被激活，活化的血小板会分泌颗粒成分，暴露促凝血膜磷脂，从而加速凝血酶的产生。凝血紊乱最终会导致移植物内血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA），且移植受体伴随发生系统性消耗性凝血病[17]。研究表明，不管移植物是否发生急性体液性排斥反应，凝血紊乱均可发生，这与非αGal抗原-抗体反应有关，且异种肝、肺移植后极易出现凝血紊乱，可在术后几分钟至数小时内发生严重的血小板耗竭，加重凝血功能障碍，导致致死性出血，其病理严重程度会明显高于心脏移植或肾移植[18]。

4 临床异种器官移植需提高移植物生理相容性

除了免疫方面的不相容性，异种器官移植后还会存在生理功能是否相容的问题。对于原位心脏移植，在供体猪中敲除生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）是一种防止异种移植心脏过度生长的有效策略[19]。异种心脏移植临床试验中使用的供体猪就是在GGTA1-敲除（knock out，KO）/β-1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）-KO/ 单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）-KO的基础上实现了GHR基因敲除。在异种肾移植中，早期更多关注的是移植后蛋白尿问题，而最近的研究中均没有观察到蛋白尿现象，这表明它与免疫反应有关。研究表明，除了猪促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）和灵长类动物EPO受体之间可能存在的差异外，猪和灵长类动物的肾功能在临床上没有显著的生理性不相容[20]。与心脏、肾移植相比，肝移植的情况更为复杂，猪肝产生的100多种蛋白质可能不会在人体内充分发挥作用。科学家已证实了原代人肝细胞和猪肝细胞在凝血蛋白表达和功能调节方面存在物种特异性差异[21]，因此，需要对供体猪进行更多的基因改造，使其能产生人类需要的功能蛋白。

5 临床异种器官移植需重视种间感染风险

临床异种器官移植中的供体猪需要在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）和（或）无指定病原体（designated pathogen free，DPF）的环境中培育和饲养，以降低细菌、病毒和寄生虫等微生物的跨物种传播风险[22]。尽管猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是一种以前病毒DNA形式整合入猪基因组中的反转录病毒，只能通过基因编辑的手段清除[23]，但由全球异种移植领域专家共同起草的《长沙宣言》明确阐明PERV实际传播的风险不仅很小并且可控[24]。科学研究表明，嗜人重组PERV-A/C原病毒只能在极少数的小型猪中发现，而在其他猪中却没有发现，即使应用高度敏感的293T细胞，将其分离为能够在人类细胞上复制的传染性病毒也极其罕见[25]。同时，我国科学家已成功筛选与鉴定出未经CRISPR/Cas9处理的PERV pol基因缺陷小型猪[26]，有效避免了多种基因修饰对猪的健康生长造成的潜在威胁，且可大规模繁育，为批量生产符合安全标准的猪器官和组织提供了保障。

6 临床异种器官移植需优化免疫抑制方案

基因编辑可以缩小但不能完全消除供受体的种间差异，因此，一定程度的免疫抑制治疗仍然是必需的[5]。研究表明，传统以他克莫司为基础的免疫抑制方案不足以有效克服异种免疫排斥反应，其在抑制适应性免疫反应方面效率较低。因此，在临床前试验中，一般会增加单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的使用，如采用抗CD154 mAb（aCD154 mAb）或aCD40 mAb去阻断CD154/CD40共刺激通路，抑制抗原提呈细胞和T细胞活化[5]，同时，研究表明阻断CD154/CD40共刺激通路的效果要优于阻断CD28/B7共刺激通路[27]。CD154被证实在活化的CD4+T细胞表面大量表达，而CD40由专职抗原提呈细胞表达，包括树突状细胞、单核吞噬细胞、B细胞以及CD8+T细胞。尽管现有的实验已证实aCD40 mAb对于延长异种移植物存活的有效性[5]，但在预防早期移植物丢失方面，aCD154 mAb的治疗效果可能会优于aCD40 mAb[28]。 此 外，aCD4 mAb和 aCD8 mAb可有效清除灵长类动物受体的T细胞，显著改善移植肾功能并延长受体存活时间[7]。在心脏移植过程中，aCD20 mAb则被用来清除B细胞，显示出一定效果[6]。需要注意的是，异种器官移植的免疫抑制强度明显高于同种器官移植，这也导致了因感染所致的移植物丢失和受体病死率明显增加[10]。

7 临床异种器官移植需筛选供体基因编辑类型

目前认为，对于供体猪的基因编辑并不是越多越好，过多的基因编辑不仅降低了供体猪的存活率，同时也增加了新的异种抗原暴露的机会[5]。尽管有学者认为，异种器官移植临床前试验中CMAH为非必要敲除基因，但对于临床试验而言，供体猪的GGTA1-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO是必需的，在此基础上适当转入人源化的补体抑制因子、凝血调节因子和抗炎抗吞噬因子会在一定程度上改善移植物功能。有学者提出，适合临床应用的供体猪应该是“9-基因”编辑，即 GGTA1-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hTM/hEPCR/hHO-1/hCD47[29]。而异种心脏移植临床试验中所使用的供体猪为“10-基因”编辑，就是在此基础上增加了针对心脏过度生长的GHR基因敲除[9]。

8 临床异种器官移植需选择适宜受者人群

对于异种器官移植临床试验，针对不同的移植器官类型有不同的适宜受者人群。肾移植适宜人群包括：（1）快速复发性肾病患者，如复发性的局灶性硬化性肾小球硬化症、复发性IgA肾病、复发性Ⅱ型膜性增生性肾小球肾炎等；（2）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）高致敏患者；（3）血管通路缺失患者；（4）无明显伴发疾病的老年患者[30]。心脏移植适宜人群包括：（1）二次心脏移植患者；（2）对HLA高致敏患者；（3）因解剖或病理性因素导致心室辅助装置（ventricular assist device，VAD）无法植入患者；（4）限制性心肌病患者；（5）捐献者和受者心脏大小不匹配患者。肝移植适宜人群包括：（1）急性暴发性肝衰竭患者；（2）同种肝移植发生肝动脉栓塞或原发性移植肝无功能患者；（3）慢性肝病中急性失代偿期患者[30]。肺移植适宜人群包括：（1）需要长期体外膜肺氧合支持患者；（2）同种肺移植后发生慢性排斥反应患者（闭塞性细支气管炎综合征）；（3）需要接受肺和其他器官联合移植患者[30]。

9 临床异种器官移植需完善异种移植指南

在异种移植监管层面，全球异种移植临床研究规范国际研讨会两次在我国长沙召开，世界各国专家在广泛和深入讨论的基础上，共同起草了针对世界 卫 生 组 织（World Health Organization，WHO）所有成员国的临床异种移植研究规范——《长沙宣言》[24]。美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）为推进异种移植临床试验，多次修订了《来源动物、产品、临床前和临床问题有关异种移植产品在人类使用》的行业指南。我国为推进异种移植临床研究的安全、顺利开展，规范异种移植临床研究行为，根据相关法律和规范，中华医学会器官移植学分会异种移植学组从总则、项目申请与审查、技术标准、伦理要求、生物安全、项目管理、追踪随访等方面，初步制定了我国异种移植临床研究指导意见[31]。

10 临床异种器官移植需明确大众认可度

不同宗教信仰的世界各国人民对于异种器官移植的接受程度明显不同，但总体认可度尚可。犹太教并不反对异种器官移植延长和拯救人类生命，保护生命几乎毫无例外地比其他价值观更重要；基督教认为，只要人类的尊严和完整性得到保护，动物是根据公认的道德标准对待的，那么异种器官移植在促进人类健康方面就是合理的；伊斯兰教提出非猪源性异种器官移植作为一种拯救生命的治疗方式在一定条件下是被允许的[32]。调研显示，美国公众普遍认为异种器官移植是一种令人兴奋且可接受的器官替代治疗方法[33]。德国公民团体认为异种器官移植的好处大于风险，但呼吁采取严格的监管措施，以确保可持续和合乎伦理的生物技术发展[34]。英国和澳大利亚的研究显示，很大一部分糖尿病患者可接受异种器官移植产品[35]。我国台湾地区的被调查者亦认为发展异种器官移植很重要，异种器官移植对人类社会利大于弊[36]。

11 展 望

我国器官移植始于20世纪60年代，发展至今已是世界器官移植大国，仅次于美国。据统计，我国每年需要接受器官移植的患者超过30万。自2015年1月实施公民自愿器官捐献起，截止至2022年3月，共实现捐献38 681例，捐献器官116 092个，每年接受器官移植的患者仅有1万余例。因此，在积极推行公民自愿器官捐献的同时，我国亟需大力发展异种器官移植研究，以解决器官移植供需严重失衡的问题。2022年可谓是异种器官移植的新元年，当前我国正面临着巨大的契机和挑战，应继续加强异种器官移植领域的技术攻关，重视异种器官移植理论认知水平的提升、新型免疫抑制剂的研发、DPF级大动物繁育设施的建设、临床前研究经验的积累，以及相关法律法规的完善等，并加快搭建异种器官移植从基础研究到临床应用的桥梁，提升我国在异种器官移植领域的国际竞争力，以解决人类重大健康需求。