3种菌纹橡胶木的偏光荧光分析

闫 妍，秦 磊*，黄琼涛，张玲梅，邱 坚

(1.西南林业大学 云南省木材胶黏剂及胶合制品重点实验室，云南 昆明 650224；2.宜华生活科技股份有限公司，广东 汕头 515800)

真菌在木材上生长使木材着色形成花斑[1]。这个着色过程形成的图案具有别具一格的自然特征，因此长期被人们因“物以稀为贵”应用于反映不平凡魅力的工艺场所。人工培植菌纹木也逐渐成为国内一种获得高档新型木制装饰材料的途径。花斑木又称菌纹木，按着色效果可分为：菌纹线、染色、腐朽，其中菌纹线是最具价值的一种[2]。从15世纪开始，西班牙等国家将菌纹木应用于教堂的镶嵌画、工艺品和贴面单板上[3]。目前，我国对于菌纹木的应用研究，还处于初始阶段。现有7种真菌能形成稳定的花斑：多形炭角菌(Xylariapolymorpha)、白腐菌(Trametesversicolor)、烟管菌(Bjerkanderaadusta)、冬生多孔菌(Polyporusbrumalis)、丝孢菌(Arthrographiscuboidea)、小孢绿盘菌(Chlorociboriaaeruginascens)以及长喙壳属菌(Ceratocystisvirescens)[4]。将菌种两两组合接种有利于形成数量、类型均更多的花斑，其中多形炭角菌可独立形成花斑。一定菌种在一定树种上形成的花斑是固定不变的[5]。

本研究选用未干燥处理的橡胶木(Heveabrasiliensis)薄板为试验对象，因其材色浅，着色效果显著；木材收缩率低，具有稳定薄板尺寸的效果；且新伐橡胶木的薄壁细胞组织中含有较高含量的碳水化合物，能够满足花斑真菌的生长条件[6]。橡胶木作为一种极具广阔前景和社会经济效益的人工林树种的地位已得到国际社会的承认[7]，因此将橡胶木菌纹薄板运用在家具行业上，不仅推动了环保材料的更新，而且扩宽了木质产品的应用，满足了人们对“唯一性”的精神追求[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

材料：选用的是从野外采集、分离的菌株和西南林业大学木材科学实验室何海珊[1]博士所保存下来的菌株。选用的木材是未干燥处理的橡胶木薄板。

其他材料:马铃薯、葡萄糖、琼脂、过滤水。

化学试剂：75%酒精、95%酒精、0.1%升汞。

1.2 仪器设备

仪器设备具体见表1。

表1 试验设备

其他仪器：250 mL锥形瓶、培养皿、玻璃棒、烧杯、培养瓶、解剖刀、镊子、培养瓶。

1.3 木材含水率测定

根据培养瓶的大小把橡胶木切割成6.5 cm×15 cm×0.2 cm的薄板，用鼓风干燥箱以(60±5)℃烘至绝干，待橡胶木薄板绝干后称其质量(m0)。

将每瓶培养瓶种加入橡胶木薄板1片，加入不等量的无菌水，不等量无菌水每个梯度重复3，置于立式压力蒸汽灭菌器里灭菌(121 ℃ 0.1MPa)30 min，取出，冷却6～8 h后称量薄板的质量(mt)。含水率公式如式(1)所示[1]。

K=[(mt-mo)]×100%

(1)

以加水量为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 mL来测量木材含水率，试验表明，菌株ZXH18-6在含水率为41.394%～46.003%时生长较好，形成大量的菌纹线和花纹，在含水率为33.037%时，仅在表面形成黑色染色。菌株ZXH63-4在含水率为79%～99%形成的表面花斑量最多，在含水率为52%～99%形成的内部花斑量最多；ZXH63-4形成的平均花斑量最多(图1)。

图1 木材含水率

1.4 固态菌株接种形成菌纹木的试验方法

1.4.1 菌株扩繁 从保存菌株的试管中挑起一些菌丝(或从野外采集来的菌纹木标本中采集样品)，在超净工作台上，把菌丝接种在PDA平板上，放置于恒温恒湿箱中培养7～14 d。

1.4.2 橡胶木薄板灭菌 把橡胶木薄板放置于加有24 mL无菌水的培养瓶中，使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌45 min，放置超净工作台上。

1.4.3 固态菌株接种 在接种前把培养瓶中的水分倒出，用解剖刀把PDA上的菌落切成约2 cm的小块贴在薄板上，把接种好的薄板放在恒温恒湿箱中培养56 d后取出来观察是否产生菌纹线[9]。

1.5 偏光、荧光观测

1.5.1 木样处理 将菌株ZXH 18-6和ZXH 63-4制备成功的橡胶木菌纹薄板用聚乙二醇(PEG)包埋处理菌纹木薄板。PEG包埋将橡胶木薄板按2 cm×2 cm尺寸切割，放入无菌水中浸泡至饱水状态。配制含量为30%、50%、70%、85%、100%的PEG溶液，将菌纹木薄板依次放入恒温60 ℃的PEG溶液中浸泡24 h。处理好的菌纹木如图2。

图2 包埋后的菌纹木

1.5.2 切片制作 将无菌水点在样品上，甘油涂抹刀片，游走切片机切16～20 μm的切片。把切片放入无菌水中清洗甘油，用软毛毛刷按照横切面、径切面、弦切面的顺序依次放在载玻片上，滴甘油盖好盖玻片，放置于恒温加热板上除去气泡。其中菌株ZXH18-6培育的菌纹薄板选取了上端的花纹处和下端的黑色染色处2个部分做切片分析。

1.5.3 切片观测 木材的纤维素分子有序排列形成的结晶区具有双折射型，在偏光显微镜下会发亮，由此可以通过观察图像的明暗程度来判断纤维素的降解程度[10]；木材中的木质素因其含有的酚类物质会产生荧光，在荧光显微镜下观察荧光的强弱可以判断木质素的降解程度[12]。

将切片放于尼康数码显微镜下用普通光、偏光、荧光观察菌纹木的纤维素和木质素的降解程度，并拍摄图像分析。

2 结果与分析

2.1 菌株特征分析

将从实验室保存的菌株ZXH7-2、ZXH28、ZXH62-2、ZXH18-6、ZXH63-4和野外采集的菌株2a、2b、2c在恒温箱中培养8 d，经分离、纯化后观察形态特征(表2)。

表2 8种菌株的形态特征

2.2 菌纹木宏观分析

经过56 d的固态菌株接种培养，ZXH18-6、ZXH63-4长出了菌纹线。

鉴定结果：Diaporthesp.

分类地位：半知菌亚门Deuteromycotina腔孢纲Coelomycetes球壳孢目Sphaeropsidales，有性阶段属于子囊菌亚门Ascomycotina核菌纲Pyrenomycetes炭角菌目Xylariales间座壳科Diaporthaceae间座壳属Diaporthe[12-13]。

表3 所培育出的菌纹木宏观分析

2.3 偏光和荧光显微镜分析

由表4可知，普通橡胶木薄板与菌纹橡胶薄板偏光和荧光发亮程度没有明显差异，且细胞壁未发生明显的破损与凹陷分裂，黑色菌纹线两侧偏光及荧光的发亮程度没有明显变化。说明菌纹薄板花纹部分的横切面木质素和纤维素的降解程度都比较轻[14-15]。

表4 普通橡胶木与菌纹橡胶薄板横切面普通光、偏光、荧光对比

由表5可知，菌株ZXH 18-6培育的菌纹木薄板径切面交叉纹孔处的细胞没有发生断裂，菌株ZXH 18-6、ZXH 63-4据荧光和偏光显微镜观察，光亮强弱程度无明显差异。

表5 普通橡胶木与菌纹橡胶薄板径切面普通光、偏光、荧光对比

表6 普通橡胶木与菌纹橡胶薄板弦切面普通光、偏光、荧光对比

通过比较菌株ZXH18-6偏光图像的花纹处与染色处，发现花纹处的纤维素降解程度轻(橡胶木薄板花纹处的含水率比染色处低一些)；在荧光显微镜下花纹处比染色处光亮强,说明染色处的木质素的降解程度较严重，因此木材本身的含水率越高，越容易对木材造成腐朽[16]。

综上所述，在荧光和偏光显微镜观察下发现，菌株ZHX18-6、ZHX63-4培育的菌纹木和橡胶木正常材比较光亮程度没有明显差异，未见菌丝，没有观察到木质素和纤维素明显的降解现象[17-18]，即在56 d内花斑真菌ZHX18-6、ZHX63-4对木材的腐朽情况影响不显著。由此，在严格控制花斑真菌的菌种、生长时间和木材含水率的情况下，将培育的菌纹薄板应用在家具设计上是可能实现的。

3 结论与讨论

本研究是从野外提取和西南林业大学何海珊博士所保存的菌株人工制备橡胶木菌纹薄板，并将制备成功的薄板进行切片拍荧光和偏光图像来分析其木质素和纤维素的降解情况。

在培育菌纹木时没有加入蛭石，仅使用单种菌株接种制备菌纹木薄板，其中ZHX18-6和ZHX63-4形成了菌纹线，说明在没有不良环境的阻碍或真菌种间的相互抵抗下也能形成菌纹线。

木材的含水率对花斑真菌的生长尤其重要，本研究采用橡胶木薄板倾斜放于培养瓶中加水灭菌后造成木材上端含水率比较低，从而导致木材的含水率测量不精确。

在制备菌纹木试验中发现菌株ZHX18-6在含水率为41.394%～46.003%生长较好，可以形成大量的菌纹线和花纹，在含水率为33.037%只在表面形成黑色染色。

用荧光和偏光显微镜观察木质素和纤维素的降解程度没有出现显著现象，菌株ZHX18-6形成的菌纹木下端的木质素和纤维素降解程度比上端较严重一些，表明含水率越高的地方，木质素和纤维素降解得越快，同时也越容易造成木材腐朽现象。