桦褐孔菌多酚类物质的相关研究进展

张慧敏 安芳芳 吴宇圳 郑永标

（福建师范大学生命科学学院，福建福州 350117）

桦褐孔菌Inonotus obliquus，是一种生长于白桦树上的药用真菌[1]，主要生长在北半球北纬40°~50°的地区，分布于俄罗斯西伯利亚、俄罗斯远东地区、北欧、日本北海道、朝鲜、中国黑龙江、中国长白山等地。早在16世纪，北欧、东欧等国家已用桦褐孔菌治疗癌症、糖尿病[1]等疾病，俄罗斯将桦褐孔菌称为“西伯利亚灵芝”。近年来，韩国、美国等国家将桦褐孔菌提取物加入沐浴露、精华乳、补水面膜、洗发液、抗皱眼霜等各种美妆产品中，作为抗氧化剂广泛使用。我国对桦褐孔菌的开发利用处于起步阶段，市场上的产品大多数为用于泡水的菌块，由子实体制成的压片糖果或是代用茶等，少数为美妆产品，如“稀物集”松茸蘑菇系列、“皙岛”白桦茸酵母水等。目前，桦褐孔菌的相关产品存在主要功效成分不明确，化学质量标准有待进一步确定等问题。近年来研究表明，桦褐孔菌含有丰富的多酚类物质，具有抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抑菌[4]等作用。此外，桦褐孔菌野生资源有限，且人工栽培子实体较为困难。因此，近年来学者常用桦褐孔菌液体深层培养菌丝体及代谢产物来替代野生桦褐孔菌子实体开发相关产品。笔者总结桦褐孔菌中多酚类物质的化学结构、生物活性、提取工艺及采用液体发酵技术提高桦褐孔菌多酚类物质相关研究，以期为桦褐孔菌的开发与利用提供参考。

1 桦褐孔菌多酚类物质的结构鉴定

近年来，学者发现桦褐孔菌中含有化学结构多样的多酚类物质，2007—2021年[5−9]，共报道28种桦褐孔菌多酚类物质（表1、图1），其中，25种多酚类物质（序号1—25）从子实体中分离得到，3种多酚类物质（序号26—28）从菌核中分离得到。此外，4−羟基−3，5−二甲氧基苯甲酸2−羟基−1−羟甲基乙酯（序号1），2，5−二羟对苯甲酸（序号7），Inonoblins A、B、C（序号17—19）为桦褐孔菌中发现的新天然化合物。

图1 桦褐孔菌多酚类物质的化学结构

表1 桦褐孔菌多酚类物质的种类

2 桦褐孔菌多酚类物质的生物活性

2.1 抗氧化作用

桦褐孔菌多酚类物质具有较强的抗氧化能力，能通过清除羟基自由基、抑制脂肪氧合酶活性、淬灭H2O2、抑制脂质过氧化反应等多种途径发挥其抗氧化作用[10]。CUI等[11]用80%乙醇提取及冷冻干燥技术在室温下从桦褐孔菌子实体中获得多酚类物质提取物，质量浓度为10~50µg/mL，该提取物对过氧化氢诱导的细胞损伤具有较好的保护作用，且质量浓度为50µg/mL的多酚类物质提取物的作用效果与0.4 mg/mL的过氧化氢酶相当。高晗等[12]采用邻二氮菲−Fe2+氧化法与邻苯三酚活性测定法，发现0.2%的桦褐孔菌多酚类物质对羟自由基和超氧自由基的清除率可达69.58%、82.01%。潘林等[13]在超声−微波协同萃取法辅助下，用50%乙醇提取桦褐孔菌多酚类物质，发现提取物对DPPH自由基清除率的IC50值为9.03µg/mL，对羟自由基清除率的IC50值为2.03 mg/mL。上述研究结果表明，桦褐孔菌多酚类物质具有较好的抗氧化活性，具有进一步研究的价值。

高愿军等[14]用48%乙醇于75℃下浸提桦褐孔菌50 min，得到的粗提物用乙酸乙酯萃取获得多酚类物质，发现该多酚类物质可提高昆明种小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶的活性，显著提高血清中的总抗氧化能力，并可降低小鼠血清中丙二醛（MDA）含量。而蔡建秀等[10]利用无菌级小鼠构建对照试验，体外抗氧化试验发现，4.0 mg/mL桦褐孔菌多酚类物质对H2O2诱导的小鼠红细胞溶血抑制率为69.65%，与对照组相比，桦褐孔菌多酚类物质可极显著地抑制小鼠肝匀浆自发性产生的MDA；体内抗氧化试验，注射桦褐孔菌多酚类物质的小鼠体内肝组织MDA的产生也受到显著抑制，抑制率可达66.84%，且小鼠血清与肝匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著增强。因此，上述动物试验表明，桦褐孔菌多酚类物质在体内外均具有明显的抗氧化作用。具有抗氧化活性的物质不仅能预防衰老，还能预防许多由自由基引起的与老化相关的疾病，对相关产品的开发具有借鉴作用。

2.2 抗肿瘤作用

桦褐孔菌的多酚类物质具有明显的细胞毒活性。YUKI等[15]用80%甲醇浸提桦褐孔菌子实体，提取分离的7种多酚类物质（序号1—7）对4种癌细胞（A549、PA−1、HL−60和U937）均具有较强的细胞毒性，但对正常细胞系（IMR90）的细胞毒性较低；其中，3，4−二羟基苯甲丙酮（序号3）对正常细胞的半致死量LD50为272.8µmol/L，对癌细胞PA−1的LD50为12.2µmol/L，具有较好的成药性。流式细胞仪分析表明，3，4−二羟基苯甲丙酮（序号3）作用于G2/M期，且能通过阻断I−kBα激酶激活来抑制核因子kB，从而刺激肿瘤坏死因子−α诱导细胞凋亡；进一步构效分析发现，分子尾部带有醛或酮的3，4−二羟基苯甲丙酮（序号3）比带有游离羧基的咖啡酸（序号2）具有更强的抗肿瘤活性。MIZUSHINA等[16]发现咖啡酸（序号2）和3，4−二羟基苯甲丙酮（序号3）能够直接与拓扑异构酶Ⅱ结合，抑制其活性（IC50值分别为15µmol/L、10µmol/L），显著抑制人结肠癌HCT116细 胞 的 增 殖（LD50分 别 为70.0µmol/L、49.4µmol/L），并使细胞周期停止在G2/M期，且呈剂量依赖性。

以上研究结果表明，桦褐孔菌多酚类物质具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制拓扑异构酶Ⅱ活性等作用，具有较大的治疗肿瘤潜力，但其作用机制有待进一步研究，也需要通过动物试验与临床试验来进一步评估其抗肿瘤作用。

2.3 抑菌作用

桦褐孔菌多酚类物质有较好的抑菌作用。戴航宇等[17]用50%乙醇，在60℃，料（g）液（mL）比为1∶20的条件下浸提桦褐孔菌子实体粉末，获得桦褐孔菌多酚类物质对大肠杆菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌均有抑制活性；当桦褐孔菌多酚类物质质量浓度为10 mg/mL时，对金黄葡萄球菌抑制效果最好，抑菌圈直径达19.5 mm，比对枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈分别高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%，对革兰氏阳性菌的抑制能力优于革兰氏阴性菌。

3 桦褐孔菌多酚类物质提取工艺优化

对桦褐孔菌多酚类物质的提取工艺优化，有利于桦褐孔菌多酚类物质的充分开发利用。桦褐孔菌多酚类物质的分子结构中有多个酚羟基，极性较大，易溶解于醇、醚、酮类溶剂，乙醇是一种渗透性强、提取率高、毒性小的萃取剂[18]。桦褐孔菌多酚类物质的常用提取溶剂为乙醇−水。高洋等[19]用70%乙醇，料（g）液（mL）比为1∶20，于80℃条件下提取桦褐孔菌多酚类物质，含量达3.2%。张梅梅等[20]通过正交试验优化桦褐孔菌多酚类物质的提取条件，用50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶10，提取温度50℃，浸提时间45 min，多酚类物质的提取率为3.1%。

为了进一步提高多酚类物质的提取率，研究者还采用超声波与微波辅助技术进一步优化提取工艺。梁丽雅等[21]采用超声波辅助提取桦褐孔菌多酚类物质，通过正交试验优化的最佳工艺为60%乙醇，超声处理时间30 min，超声功率500 W，料（g）液（mL）比1∶30，在此条件下提取的多酚类物质对DPPH自由基清除率可达75.39%。董琦等[22]通过微波辅助提取桦褐孔菌多酚类物质，最佳工艺为50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶50，微波功率560 W，微波时间180 s，桦褐孔菌多酚类物质提取率为3.19%。桦褐孔菌多酚类物质提取工艺的优化为桦褐孔菌产品开发提供保障。

4 桦褐孔菌多酚类物质发酵工艺优化

桦褐孔菌多酚类物质具有较好的生物活性，在医疗产品与食品方面具有较好的开发前景，但桦褐孔菌的野生资源有限，制约桦褐孔菌的相关产品研发。近年来，通过液体发酵获得桦褐孔菌菌丝体并提高多酚类物质含量成为桦褐孔菌的重要研发方向。

研究表明，通过向培养液中添加5‐氮杂胞苷、木质纤维材料、糙米混合物、激发子、有机溶剂等，可有效地提高桦褐孔菌液体发酵产物中的多酚类物质含量。赵艳霞等[23]在培养液中添加100µmol/L的5‐氮杂胞苷，能提高桦褐孔菌菌丝体内与多酚类物质合成相关的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4−香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、硬毛素合成酶（SPS）基因的表达水平，改变SPS启动子区的组蛋白甲基化修饰，提高组蛋白H3K4、H3K36的甲基化修饰水平，使桦褐孔菌菌丝体细胞内多酚类物质积累量由对照组的28.7 mg/g提高至46.6 mg/g，胞外多酚类物质的体积质量由对照组的66.9 mg/L提高至92.3 mg/L。ZHU等[24]向液体培养液中分别添加木质纤维材料小麦秸秆、甘蔗渣、稻草，使桦褐孔菌胞外多酚类物质质量分数分别提高106.9%、67.6%、151.2%，胞内多酚类物质质量分数分别提高26.1%、38.9%、45.3%，三者胞外多酚类物质中的表儿茶素−3−没食子酸酯、表没食子儿茶素−3−没食子酸酯、phelligridin G均显著增加，此外还大量生成对照培养基中未发现的Davallialactone、inoscavin B。王艳梅等[25]将玉米、红小豆、糙米（1∶1∶1）混合并粉碎至颗粒直径0.25 mm以下，用该基质培养的桦褐孔菌，多酚类物质质量分数可达22.48 mg/g。魏志文等[26]在桦褐孔菌液体培养液中加入50µg/L黑曲霉细胞壁碎片作为真菌激发子，培养的桦褐孔菌菌丝体胞内和胞外多酚类物质体积质量最高为102.15 mg/L、311.91 mg/L；进一步研究表明真菌激发子能够显著提高一氧化氮合酶活性，进而提高一氧化氮的含量，从而提高桦褐孔菌的代谢速率，最终提高多酚类物质的产量。沈梦薇等[27]在桦褐孔菌培养基中添加能够改变细胞膜通透性的丙酮，进而影响细胞对营养物质的吸收，可提高桦褐孔菌胞内外多酚类物质产量与活性，其中胞内多酚类物质质量分数达7.84 mg/g，是对照组的2.5倍，且二苯代苦味肼基自由基清除率达85.97%，为对照组的3倍。此外，光照条件对多酚类物质的生成也有影响[28]。

以上研究结果表明，5‐氮杂胞苷、木质纤维材料、糙米混合物、多糖类物质、有机溶剂等诱导剂是提高桦褐孔菌发酵培养时胞内外多酚类物质含量的有效方法。

5 展望

总结桦褐孔菌多酚类物质的结构、生物活性及提取工艺的研究进展，为桦褐孔菌开发利用提供参考。桦褐孔菌多酚类物质不仅具有抗氧化、抗肿瘤和抑菌等作用，还具有改善肝脏脂质[29]、抑制肝细胞凋亡[30]、调节血脂水平[31]、提高外周淋巴细胞的生存能力[32]、调节血糖[33]、缓解宿醉[34]和延长食用油货架期[35]等作用，具有较广阔的市场应用前景。但由于桦褐孔菌野生资源有限，其各类产品的研发受限制，尤其是基于多酚类物质功能性产品的开发。采用液体发酵技术生产菌丝体来代替野生桦褐孔菌，是桦褐孔菌资源利用的重要研究方向。目前通过添加各种诱导剂提高桦褐孔菌多酚类物质总含量的研究取得一些进展，但对提高哪种多酚类物质含量的研究未见报道，今后应加强这方面的研究，为桦褐孔菌资源的高效利用及制定多酚类物质的化学标准提供依据。另外，多糖与三萜类成分也是桦褐孔菌的主要功效成分，如何与多酚类物质相结合来开发功能多样的桦褐孔菌产品，也是桦褐孔菌资源利用的重要领域。