液相色谱质联法测定火锅底料中合成辣椒素

董叶箐，刘强欣，杨明，孙文闪*，郑剑峰，钟寒辉

1.绿城农科检测技术有限公司（杭州 310000）；2.杭州郝姆斯食品有限公司（杭州 310000）

火锅作为一种便捷的美食，在我国川渝餐饮文化中占有重要地位。随着经济的发展，各地区之间餐饮文化的交汇，火锅这一便捷的美食受到越来越多消费者的喜爱。而火锅产业的蓬勃发展离不开火锅底料。而辣椒作为火锅底料的重要原材料之一，辣椒里的辣椒素类物质赋予了火锅底料90%以上的辣感[1-2]。辣椒碱是一类N-香草基酰胺类生物碱的物质，其中天然辣椒素和二氢辣椒素占总辣椒碱的90%以上[3-4]。合成辣椒素是人工合成的具有类似于天然辣椒素生物功能的物质，由于其价格与辣度的绝对优势受到不法商贩的青睐，进而在火锅底料里添加合成辣椒素来替代天然辣椒素和二氢辣椒素满足消费者对辣感的需求。因此建立一种简单快速准确的测定火锅底料中合成辣椒素的检测方法对保障人们舌尖上的安全具有重要意义。

目前，辣椒素的检测方法有分光光度法[5]、液相色谱法[6-11]、液相色谱-串联质谱法[12-17]和气相色谱-串联质谱法[18-19]。分光光度法检测结果为辣椒素含量的总和，不能对单一组分的含量进行定量检测，且灵敏度低；液相色谱法的方法检出限较高，通过保留时间进行定性，容易产生假阳性；气相色谱-串联质谱法前处理需要对辣椒素进行衍生化，反应不稳定且操作麻烦，液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、定性定量准确、分析速度快等优点，适合于痕量级辣椒素的测定，当前主要应用于油脂中辣椒素类物质的检测，对于火锅底料这样复杂基质，目前未见到相关的报道，文章对样品前处理和上机测定条件进行了优化，建立了固相萃取净化液相色谱串联质谱法测定火锅底料中的合成辣椒素的方法，该方法简单快速、灵敏度高、准确稳定，并通过实际样品的检测验证方法的可靠性，为市场监管部门对火锅底料的质量监控提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC30A超高液相色谱8050三重四极杆质谱，配电喷雾离子源（日本岛津公司）；DMT-2500多管涡旋混合仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；ST16R高速冷冻离心机（赛默飞世尔公司）；Millipore超纯水机（美国Millipore公司），BSA224S电子天平（德国赛多利斯公司）；Supelco固相萃取装置（上海安普股份有限公司）。

正己烷、乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国Thermo公司）；试验用水为一级水；其他试剂均为国产分析纯。合成辣椒素（纯度94.0%，美国CATO公司）。

样品为市售火锅底料。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液：精确称取0.013 28 g的合成辣椒素用甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，得到500 mg/L标准储备液，于-20 ℃避光保存。标准中间液：准确吸取1.00 mL储备液，用甲醇稀释定容至100 mL容量瓶，得到5.0 mg/L。标准曲线现配现用，用10%的乙腈水溶液稀释配制0.025，0.05，1，5，10，20和50 μg/L标准工作液。

1.2.2 前处理方法

提取：称取（1.000±0.005）g样品于50 mL离心管中，加入15 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液，涡旋1 min，超声20 min，按8 000 r/min离心3 min，将上清液全部转移到50 mL离心管中，再加入5 mL正己烷，涡旋30 s，按8 000 r/min离心3 min，弃去上层正己烷，下层提取液加入1 mL 4 mol/L硫酸溶液混匀，待净化。

净化：将全部提取液过PLS小柱（预先5 mL乙腈、5 mL水活化）弃去不要，加入5 mL乙腈-水（20∶80，V/V）淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱，加入5 mL乙腈洗脱，收集全部洗脱液至10 mL刻度管，于40 ℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈（90∶10，V/V）涡旋30 s，超声30 s复溶，过0.22 μm PTFE滤膜，待上机检测。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3 mm×150 mm，2.7 μm）；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流速为0.25 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度程序

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子源正离子扫描模式，Heat Block温度：400 ℃，毛细管电压：3 000 V；雾化气流量：3.0 L/min；加热气流量：10.0 L/min；DL管温度230 ℃，Interface温度280 ℃。定量与定性离子对的质谱参数见表2。

表2 合成辣椒素的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

辣椒素类化合物结构中存在酰胺基团，在电喷雾正离子模式下易得到质子，从而形成[M+H]+准分子离子峰。将1 mg/L合成辣椒素标准溶液在质荷比m/z100.0～400.0范围进行一级扫描，找到其母离子m/z294.2，然后再对母离子进行二级质谱扫描（子离子扫描），确定相应的两个子离子分别为m/z137.0和m/z170.2，对母离子和子离子进行Q1偏转电压，碰撞能量和Q3偏转电压优化，使得两离子对响应达到最佳值，优化的结果见表2。

2.2 液相条件的优化

合成辣椒素的结构中包含苯环和直链碳官能团，因此极性较弱，适合采用C18柱进行分离，比较了安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3 mm×150 mm，2.7 μm），月旭Ultimate AQ-C18（2.1 mm×100 mm×1.8 μm），菲罗门 Kinetex C18（3 mm×150 mm，2.7 μm）对其分离保留效果，结果见图1。从图1可以看出，采用安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱分析，其峰型和响应较好，因此选择InfinityLab Poroshell 120 ECC18进行分离。

图1 不同色谱柱上合成辣椒素的MRM扫描色谱图

同时，流动相也会对目标物的响应产生一定的影响，研究比较了乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水三种流动相采用梯度洗脱对合成辣椒素质谱信号的影响，结果见图2。采用乙腈-0.2%甲酸水作为流动相时合成辣椒素的响应最好。

图2 不同流动相上合成辣椒素的MRM扫描色谱图

因此，研究采用InfinityLab Poroshell 120 EC-C18为分离柱，乙腈-0.2%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序见表1。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取剂的选择

辣椒素类物质的结构中包含苯环、直链碳等官能团，呈现一定的非极性，因此可以用甲醇、乙腈、乙醇等有机试剂来提取，而苯环上连接一个羟基，采用碱性溶液可以使其解离，增加在水溶液中的溶解性，同样可以采用氢氧化钠溶液进行提取。考虑到火锅底料基质的复杂性，含有油脂、蛋白质、色素、调味剂等，采用氢氧化钠溶液作为提取液，杂质会更少，并且方便后续过柱净化。试验发现：采用0.5 mol/L氢氧化钠溶液进行提取，可以获得满意的回收率，因此试验选择0.5 mol/L氢氧化钠溶液作为提取试剂。

2.3.2 提取方法的选择

文章比较了超声提取、振荡提取两种方法对合成辣椒素提取效果，以回收率做考察指标（加标质量分数为100 μg/kg，n=6），两种方法的提取效率见结果见图3。从图3可以看出，超声提取效果优于振荡提取，因此研究的提取方法选择超声。

图3 两种提取方法的提取效果比较（100 μg/kg，n=6）

2.3.3 提取试剂体积的优化

提取剂和提取方法确定后，需要对提取剂体积进行优化，这样可以避免过多的试验废液的产生，降低试验成本和废液处理的成本。试验比较了不同体积（5，10，15，20和25 mL）0.5 mol/L氢氧化钠溶液超声提取对回收率（加标质量分数为100 μg/kg，n=6）的影响，结果见图4。从图4可以看出，最佳的提取体积为15 mL，因此选择提取剂体积为15 mL。

图4 不同提取体积的提取效果

2.3.4 提取时间的优化

在获得满意的提取回收率的前提下，尽量减少提取的时间，提高前处理效率，需要对提取时间进行优化，当称样质量为1 g，加入15 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液，比较了不同超声时间（5，10，15，20，25和30 min）对提取回收率（100 μg/kg，n=6）的影响，结果见图5。从图5可以看出，最佳的提取时间为20 min。

图5 不同时间的提取效果

2.3.5 净化小柱的选择

不同类型固相萃取小柱的净化效果存在一定的差异，试验比较了阴离子交换柱Oasis MAX（60 mg/3 mL）、亲水亲脂平衡净化柱ProElut PLS（200 mg/6 mL）、C18固相萃取柱Cleanert S C18（1 g/6 mL）三种净化柱对火锅底料样品净化效果，基质采用香辣型火锅底料，加标质量分数为100 μg/kg，三种净化小柱回收率见图6。从图6可以看出，亲水亲脂平衡净化柱ProElut PLS优于C18固相萃取柱和阴离子交换柱。因此采用ProElut PLS作为净化的固相萃取小柱。

图6 不同小柱的净化效果

2.3.6 淋洗液和洗脱液的优化

为了获得最佳的淋洗条件，研究以不同比例的乙腈-水（0∶100，10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50和60∶40，V/V）作为淋洗液进行淋洗，将滤液进样分析。结果表明：当乙腈-水比例大于等于30∶70（V/V）时，滤液中有合成辣椒素检出，其峰面积随乙腈比例的升高而增大。为了有效去除火锅底料中的杂质，又能得到较好的回收率，研究采用乙腈-水（20∶80，V/V）作为淋洗液。

同时，对溶剂的洗脱体积进行了优化，比较了不同体积（2，3，4，5，6和7 mL）的乙腈对目标物的洗脱效果，结果见图7。从图7可以看出，当乙腈体积为5 mL时，合成辣椒素已完全洗脱，因此洗脱液的体积为5 mL。

图7 不同体积乙腈洗脱效果

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围、检出限、定量限

将0.025，0.05，0.10，1.0，5.0，10.0和50.0 μg/L的系列合成辣椒素标准工作溶液进UPLC-MS/MS分析。以质量浓度（μg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，得到标准工作曲线，线性方程为y=106 675x-24 501。其在0.025～50 μg/L质量浓度范围内，合成辣椒素线性关系良好，相关系数（R2）为0.999 5。空白样品添加回收进样测定，以3倍信噪比（rSN=3）对应样品浓度为检出限，10倍信噪比（rSN=10）对应样品浓度为定量限，合成辣椒素的检出限为0.02 μg/kg，定量限为0.05 μg/kg。

2.4.2 准确度与精密度

通过空白样品加标回收试验，考察本方法的准确度和精密度。按照已优化的提取和净化方法，选择微辣、香辣、麻辣三种空白火锅底料进行低、中、高三档质量分数（0.05，2.0和50 μg/kg）进行合成辣椒素的加标试验，每个加标质量分数做6个平行（见表3）。结果表明，在3个加标水平下，三种火锅底料样品中合成辣椒素的平均回收率为76.1%～94.2%，相对标准偏差为4.62%～9.11%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[20]规定的要求，可用于火锅底料中合成辣椒素的定量检测。

表3 回收率和精密度试验结果（n=6）

2.5 基质效应的考察

基质效应是指样品经过提取后中除目标物以外的物质在仪器分析测定时对目标物的干扰，进而对测定结果的准确性产生影响，液相色谱质谱方法的建立需要评价基质效应。研究通过基质标准溶液与溶剂标准溶液峰面积比值对基质效应进行评价。基质效应（ME）为基质标准溶液峰面积与溶剂标准溶液峰面积比值乘以100%，当ME值在90%～110%之间时，标明无明显基质干扰，可以直接用溶剂标准曲线定量。文章对微辣、香辣、麻辣三种火锅底料的基质效应进行了研究，三种基质的基质效应见表4。从表4可以看出，微辣、香辣、麻辣三种火锅底料低、中、高三档浓度的基质效应在91.3～108之间，不存在明显基质效应，因此可以用溶剂标准曲线直接定量。

表4 合成辣椒素在不同基质中的基质效应

2.6 实际样品检测

按照研究建立的检测方法对30批次火锅底料进行检测，部分火锅底料中合成辣椒素有检出，检出限在11.1～253 μg/kg之间。

3 结论

试验对前处理提取、净化、仪器的色谱-质谱条件进行了优化，选择0.5 mol/L氢氧化钠溶液进行提取，以ProElut-PLS作为净化柱，对淋洗液、洗脱液进行了优化，建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中合成辣椒素的方法。该方法前处理操作简单，基质干扰效应低，灵敏度高，线性关系、准确度和精密度均能满足方法学确认的要求，适用于火锅底料中合成辣椒素的定性和定量检测。