高效液相色谱法测不同大洲咖啡豆绿原酸和咖啡酸的含量

周湧智，毛玮琪，袁栋勇，毕建辛，张黔文，纪晓娜,2*

1.长春工程学院理学院（长春 130012）；2.吉林省城市污水处理重点实验室（长春 130012）

咖啡树是属茜草科多年生灌木或小乔木，而咖啡豆就是指咖啡树果实里面的果仁。优等咖啡豆主要产自纬度在0°至南北15°，平均海拔为1 500～3 000 m地区，咖啡是世界上最受欢迎的饮料，它有自己的特点味道和香味。咖啡中的典型化合物，如咖啡因、葫芦巴碱和绿原酸，已知会影响咖啡风味，增加了酸度，赋予了涩味苦涩。评价咖啡商品质量的化学成分及其含量、精确和准确的分析手段是用于测定这些化学物质多项调查结果为确定咖啡中的成分，包括咖啡酸、绿原酸，都是由高效液相色谱法进行分析。绿原酸具有多种生物学特性，包括抗氧化性抗细菌、抗氧化和抗癌活性特别是低血糖和降血脂的影响。咖啡酸也具有抗菌、抗病毒、中枢兴奋等生物活性[1]，通常饮用的咖啡是用咖啡豆配合各种不同的烹煮器具制作出来的。咖啡酸和绿原酸是影响各种风味咖啡的两大重要有机物质。绿原酸的含量检测是咖啡豆提取物产品质量控制的关键。杨清山等[6]研究了咖啡豆中绿原酸和咖啡因的测定方法，Azuma等[7]研究表明绿原酸不像咖啡酸能很好地从消化道吸收，而且对容易被吸收的形式几乎没有任何结构变化。蔡荣华等[12]研究了咖啡豆中绿原酸和咖啡因的测定方法，杨剀舟等[15]研究了响应面优化水-乙醇法提取咖啡豆中有机酸。段丽娜等[16]研究了测定咖啡中七种有机酸的方法。Atlabachew Minaleshewa等[17]提出了盐析辅助液液萃取法（SALLE）用于咖啡生物碱和绿原酸的提取。而目前还没有文献对于同纬度同海拔的咖啡豆进行横向比较，研究通过探索提取液中甲醇与水的配比、色谱条件等过程，进一步优化了咖啡豆提取的方法，该方法方便快捷、简单有效，可用于咖啡行业绿色咖啡样品的质量控制和产地溯源的研究，对检测咖啡质量提供了参考。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）；乙酸（色谱纯，佛山西陇化工有限公司）；咖啡酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；绿原酸（色谱纯，上海源叶生物科技有限公司）；大洋洲巴布亚新几内亚拉玛莉咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）；非洲埃塞俄比亚西达摩沃尔卡咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）；印度尼西亚苏门答腊曼特宁迷塔咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）；危地马拉奥联特SHB咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）；埃塞俄比亚耶加雪菲咖啡豆（长沙万物食品贸易有限公司）；超纯水，实验室自制。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Poroshell 120 EC-C18型高效液相色谱柱（美国安捷伦公司）；咖啡豆研磨器（90 mm×210 mm带轴承款，北京惠诚联合贸易有限公司）；针式滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.3 色谱条件分析

根据文献[4]及条件试验2.1.2小节，确定DAD检测波长：285 nm；柱温为35.0 ℃；流速：1 mL/min；进样量10 μL；流动相A：0.5%乙酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱V（A）：V（B）=95∶5（0～20 min），85∶15（20～25 min）。

1.4 样品前处理方法

用手摇磨豆机将咖啡豆打碎，根据文献[5]所述咖啡豆粉碎至0.425 mm通过率80%以上细度，每次磨碎后多次清洗磨豆机，保证下一次无杂质出现，将筛上物和筛下物混合均匀后，作为待测样。参考文献[5]和GB/T 22250—2008[9]《保健食品中绿原酸含量测定》中方法进行超声提取，即分别取五个不同产地的咖啡豆，准确称取0.500 g待测样，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL 70%甲醇溶液，室温超声提取1.5 h，等待冷却后，取0.100 mL溶液于2 mL样品瓶中，加入0.900 mL 70%甲醇后，过0.45 μm滤膜，进样检测。

1.5 定性和定量分析

利用保留时间（tR）定性分析，两种物质标准品的高效液相色谱图见图1。

图1 绿原酸和咖啡酸的混标色谱图

精密称取100.0 mg绿原酸标准品，将其全部移入50 mL容量瓶中，并用70%甲醇水定容，得到2 000 mg/L绿原酸标准品母液。采用10 mL容量瓶，用70%甲醇水稀释至质量浓度分别为5.0，10.0，25.0，50.0，75.0，100.0，200.0和300.0 mg/L的绿原酸标准品溶液，作为梯度标准工作液。

精密称取20.0 mg咖啡酸标准品，将全部其移入50 mL的容量瓶中，并用70%甲醇水定容，即配得400 mg/L咖啡酸标准品母液。采用10 mL容量瓶，用70%甲醇水稀释至质量浓度分别为0.2，1.0，2.5，5.0，7.5，15.0，25.0和45.0 mg/L咖啡酸标准梯度溶液，作为梯度标准工作液。将配制好的梯度工作曲线进样测试并采用外标法分析，结果见表1。

表1 绿原酸和咖啡酸的色谱定性分析数据

1.6 咖啡豆中绿原酸和咖啡酸浓度计算

取一定量的咖啡豆进行萃取前处理，浓缩定容，高效液相色谱检测，通过式（1）和式（2）确定咖啡酸和绿原酸的浓度。

式中：c咖啡酸和c绿原酸为试样中咖啡酸和绿原酸的质量浓度，mg/L；A为液相色谱图对应绿原酸或咖啡酸色谱峰面积，mAU·min；V为萃取、浓缩后试样体积，mL；V0为水样体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化试验

2.1.1 提取液的确定

提取不同体积分数的甲醇水溶液对咖啡豆粉的提取效果情况见表2。取5份同种同质的咖啡豆粉，按照1.3小节样品前处理方法，分别加入等量不同浓度的甲醇水溶液进行提取试验（40%，50%，60%，70%和80%体积分数的甲醇水溶液）对咖啡豆中绿原酸和咖啡酸的提取效果情况。结果表明，70%甲醇提取出的绿原酸含量均高于其他几种提取溶剂，因此选择70%甲醇作为提取溶剂。

表2 咖啡粉提取液的选择

2.1.2 流动相的选择

在流动相的选择上，根据文献[2-5]，分别用流动相[a.流动相V（0.5%甲酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5；b.流动相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5；c.流动相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=85∶15；d.流动相V（1.0%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5]对同种咖啡豆提取液进行试验。

根据图谱数据，流动相b的分离度较好，色谱峰清晰且样品流出时间较短，故选用流动相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5对于检测绿原酸和咖啡酸较为适宜。

经过以上优化试验，确定了HPLC-DAD测定咖啡豆中咖啡酸和绿原酸的色谱条件：DAD检测波长285 nm；柱温35.0 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5。

2.2 咖啡豆提取液测试

取咖啡豆水样按1.3小节方法进行前处理，色谱分析结果见图2。

图2 埃塞俄比亚西达摩咖啡豆提取液色谱分析图

按式（1）和式（2）对绿原酸和咖啡酸分别定量，结果为见表3。

表3 咖啡HPLC定量分析数据

2.3 加标回收率

对咖啡豆提取液进行3水平加标回收试验（见表4），绿原酸的回收率为82.4%～86.3%，咖啡酸的回收率为86.8%～92.4%，说明前处理检测方法可靠。

表4 三水平加标回收率

2.4 最低检出限

将含有1.600 mg/kg的绿原酸和咖啡酸的标准溶液分别多次稀释后进行液相色谱分析，至信噪比（rSN）在2～5之间，确定最低检出限，绿原酸为0.320 mg/kg（rSN=2.35），咖啡酸为0.200 mg/kg（rSN=3.58）。

2.5 精密度

取不同大洲咖啡豆的提取溶液重复测定7次，得到绿原酸和咖啡酸的平均浓度、偏差和相对标准偏差，结果见表5。对五种咖啡豆分别进行七次平行试验，检测图谱中未出现咖啡酸，故咖啡酸均未检出。

表5 咖啡豆样品中绿原酸的定量结果

3 结论

试验考察了萃取液使用甲醇和水的比例、流动相的选用和流动相的比例三个色谱条件，确定了HPLCDAD检测咖啡豆中绿原酸和咖啡酸的含量的最优条件。研究建立了一种咖啡豆中绿原酸及咖啡酸的定量方法，并使用该方法初步分析了不同大洲咖啡豆中咖啡酸和绿原酸含量的变化。结果表明，绿原酸和咖啡酸的线性关系、检出限、精密度、重复性以及加标回收率等都满足检测需求，方法简便、快速，检测设备要求低、结果准确。并可初步判断非洲产出的咖啡豆较其他大洲的绿原酸含量更高，风味更好，方法可以广泛应用于咖啡豆中绿原酸和咖啡酸的含量检测，同时也可继续优化，进一步检测咖啡豆中更多有机酸的含量。