乳铁蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

2022-11-28丰东升马颖清陈柔含杨晓君韩奕奕张维谊

食品工业 2022年11期

丰东升，马颖清，陈柔含，杨晓君，韩奕奕，张维谊

上海市农产品质量安全中心（上海 201708）

乳铁蛋白主要存在于人和动物的乳汁中，提取物多呈冻干粉状态，蛋白含量大于97%。乳铁蛋白对铁离子的亲和性非常高[1]，对热比较敏感，但在一定pH条件下，又具有一定稳定性[2]。它属于一种碱性蛋白，具有多种生物学功能，主要作用为促进铁的吸收、抗菌杀菌、抗病毒、调节免疫功能等[3-6]。由于功能丰富且安全性高，近年来，乳铁蛋白在许多国家和地区的食品领域开始得到广泛应用[7-8]。牛奶是获取乳铁蛋白最直接便捷的途径，为提高乳铁蛋白提取量，减少牛奶加工过程造成的损失，需要建立一种快速、高效、准确的方法对生鲜乳及乳制品中乳铁蛋白进行定量测定。

乳铁蛋白常见的检测方法包括高效液相色谱法（HPLC）、电泳法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。HPLC法是检测机构采用最多的检测方法，检测结果精准且重复性高，但检测时间较长，对样品的纯度要求高[9-10]。电泳法准确度高，重复性好，但操作繁琐，用时长[11]。ELISA法是将抗原、抗体的特异性反应和酶的高效催化作用相结合的一种新型的免疫学分析方法[12-14]。ELISA法主要包括直接竞争ELISA法、间接竞争ELISA法与双抗夹心ELISA法[13,15]。该方法能够快速对乳铁蛋白进行定量检测，检测灵敏度高，操作便捷，可用于高通量样本地筛选检测[16-17]。

试验利用细胞融合技术获取18株抗乳铁蛋白的单克隆抗体，并对其效价、亚型、抗原定位等各项指标进行测定，并以大分子为抗原蛋白，经3次免疫和加强免疫后，获得效价较高的抗乳铁蛋白多克隆抗体；利用试验获得的单克隆抗体和多克隆抗体，旨在建立一种以抗牛乳铁蛋白包被酶标板，抗牛乳铁蛋白单抗FL8作为检测抗体的双抗体夹心的ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验试剂和设备

乳铁蛋白标准品（98%）、DMEM培养基、弗氏不完全佐剂、胎牛血清、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等（均购自Sigma公司）；HRP标记山羊抗小鼠IgG（北京西美杰）；其他试剂均为国产分析纯；Protein G小柱（GE Healthcare）。

灭菌锅（苏州博讯，YXQ-LS-50A）；酶标仪（Thermo，MultiskanFc）；分析天平（上海天美，FA1603C）；CO2培养箱（Thermo，311）；洗板机（南京德铁，HBS-4011）；电热恒温水浴锅和干燥箱（天津诺宏仪器，101-2BS）。

1.2 试验动物

4只雌性BALB/c小鼠（6周龄，编号1～4）、1只雌性新西兰大白兔（2月龄），购自常州卡文斯。

1.3 试验方法

1.3.1 抗原的制备

在分析天平上，精确称取10 mg乳铁蛋白标准品溶于10 mL超纯水中，150 μL分装后，保存于-20 ℃备用。

1.3.2 动物免疫

1.3.2.1 小鼠免疫

取6周龄雌性BALB/c小鼠4只进行免疫，共进行3次免疫。每次每只小鼠抗原免疫用量为25 μg，具体免疫程序见表1。第2次免疫后10 d尾静脉采血，通过ELISA间接法测抗体效价，确定是否有针对抗原的抗体生成。效价不达标，则第3次继续弗氏不完全佐剂皮下进行免疫。

表1 小鼠免疫程序

1.3.2.2 兔免疫

取2月龄雌性新西兰大白兔1只进行免疫，共进行3次免疫，每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为500 μg，具体免疫程序见表2。第2次免疫后14 d静脉采血，通过ELISA间接法测抗血清效价，以此确定是否有针对目标的抗体生成。加强免疫14 d后取血。

表2 兔免疫程序

1.3.3 血清效价的测定

血清效价的测定采样常规间接ELISA法，具体如下：（1）乳铁蛋白抗原经包被缓冲液稀释成1 μg/mL后，取100 μL加入每个酶标板孔中，置于4 ℃，过夜。（2）取出所需要的酶标板条，洗涤甩干后，每孔加入200 μL封闭液，37 ℃恒温避光孵育2 h。（3）洗板后加入待测血清，待测血清用洗液梯度稀释成1∶100，1∶1 000，1∶3 000，1∶9 000，1∶27 000，1∶81 000和1∶243 000共7个梯度，空白对照为洗液，每孔中加入100 μL样品，恒温孵育45 min。（4）洗板后，每孔加入100 μL封闭液稀释过的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，恒温孵育30 min。（5）洗板后，每孔加入100 μL底物显色液，恒温孵育10～15 min。（6）每孔加入50 μL H2SO4（2 mol/L），终止反应。（7）检测波长450 nm下的OD值，检测孔吸光度记作P，对照孔吸光度记作N，以P/N≥2.1为待测血清的效价。

1.3.4 细胞融合

选取生长状态良好和效价较高的6周龄健康雌性小鼠，融合前3 d，用抗原直接加强免疫1次，剂量同前。腹腔注射0.5 mL液体石蜡致敏，1～2周后，每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，制备腹水待用。

1.3.5 抗体纯化

单抗腹水和多抗血清均采用饱和硫酸铵法进行纯化，具体操作为：常温条件下4 000 r/min离心15 min后取上清液，4 ℃下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，搅拌30 min后高速离心（13 000 r/min，4 ℃）后弃上清；沉淀重悬于PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）；继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，重复上述步骤，沉淀溶于适量的PBS缓冲液，置于4 ℃透析过夜。选用Protein G小柱纯化，纯化后的抗体通过BCA法测定蛋白浓度。

1.3.6 抗体特性的测定

单克隆抗体特性的测定主要包括抗体亚型和定位的鉴定及抗体效价的测定。其中，小鼠抗体亚型的测定是通过抗体亚型鉴定试剂盒。抗体效价的测定采用间接ELISA方法。多克隆抗体特性的测定主要是抗体效价的测定。

1.3.7 双抗体夹心ELISA检测体系的筛选

通过双抗体夹心的ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。具体操作如下：

（1）用碳酸盐缓冲液（CB）将包被抗体稀释至5 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h。

（2）洗板3～5次，拍干后加入阳性标准品和阴性对照，每孔100 μL，25 ℃反应45 min。

（3）洗板3～5次，拍干，多抗稀释一定倍数，每孔100 μL，25 ℃反应45 min。

（4）洗板3～5次，拍干，加入羊抗兔酶标二抗，每孔100 μL，25 ℃反应30 min。

（5）洗板3～5次，拍干，加入显色剂，25 ℃避光反应15 min。

（6）加入100 μL终止液，读取450 nm和630 nm处的吸光度。

1.3.8 特异性测定

按最优化的试验条件，将乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白标准品梯度稀释成0，1，10，100和1 000 ng/mL，按照双抗体夹心试验的步骤进行测定。

2 结果与分析

2.1 免疫小鼠血清效价测定

间接ELISA方法测定的小鼠血清效价结果见表3。4只小鼠血清效价均达1∶2.43×105。最终选择生长状态最好和效价较高的1号小鼠用于细胞融合。

表3 血清效价测定

2.2 抗LF单克隆杂交瘤细胞株的建立

细胞融合7 d后，培养板孔底长出肉眼可见的单克隆，通过ELISA间接法对所有细胞孔进行初筛，挑选出强阳性的细胞立即在24孔细胞培养板中扩大培养和克隆化。最终得到18株能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株，扩大培养后保存于液氮。

采用小鼠体内诱生腹水的方法，对18株杂交瘤细胞进行抗体的制备，最终获得18种腹水抗体，编号1～18号。

2.3 单克隆抗体特性测定

2.3.1 单克隆抗体亚型的测定

对18株抗LF抗体进行亚型测定的结果如表4，测定数据显示，18株抗体与IgG1反应较大，而与IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA基本上无反应，因此这18株抗体亚型均为IgG1型。其中，2、3、6、11、15、18号抗体在λ链，10号抗体既不在λ链也不在κ链，其余抗体均在κ链。

表4 单克隆抗体亚型测定

2.3.2 单克隆抗体效价测定

收集18株杂交瘤细胞，制备并收集小鼠腹水，以LF标准品包被酶标板，包被质量浓度为1 μg/mL，采用ELISA间接法测定抗体效价，效价检测数据见表5。其中，6号抗体效价为1∶1 000，10号抗体效价为1∶1.6×104，7、17、18号抗体效价为1∶6.4×104，其他抗体效价均达1∶2.56×105。

表5 抗体效价特性测定

接表5

2.4 多克隆抗体特性测定

经过4次免疫，采血，离心获得多抗血清，间接ELISA法测定兔多抗血清的效价结果见表3，LF抗原对新西兰大白兔的免疫效果很好，免疫效价达1∶2.43×105。多抗血清经饱和硫酸铵法纯化后冻干，备用。

2.5 双抗体夹心ELISA检测方法的建立

2.5.1 单抗对多抗配对筛选

通过双抗体夹心的ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出6对配对效果较好、背景较低的腹水，结果如表6所示。4号和8号腹水与多抗配对，灵敏度较高，且背景较低；对这2组配对进行条件优化及曲线标定。

表6 单抗与多抗配对结果

2.5.2 乳铁蛋白标准曲线的建立

试验按照双抗体夹心ELISA的操作步骤对一系列稀释的乳铁蛋白标准液进行测定，以OD450nm的值为纵坐标，以乳铁蛋白的浓度为横坐标，4号和8号腹水得到线性方程见表7。4号腹水试验结果显示，不同比例稀释多抗条件下，0.05～3.2 ng/mL之间均可以呈现较好的线性关系，而且检测抗体使用的稀释倍数越高，试验背景值越低，检测限为0.05 ng/mL。8号腹水结果与5号结果相同，最适检测范围为0.05～3.2 ng/mL，在该范围内呈现良好的线性关系。最终选用8号单克隆抗体作为包被抗体，命名为FL8，建立牛乳铁蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法。