基于LC-MS的不同年份葛根茯苓酵素有机成分的比较

张国栋，李旭东，杨琴，黄武军，徐向荣

1.江西农业工程职业学院（樟树 331200）；2.仁和集团发展有限公司（樟树 331200）；3.江西仁仁健康产业有限公司（樟树 331200）

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类食用的酵素产品[1]。根据《酵素产品分类导则》，酵素根据原料分为植物酵素、动物酵素、菌类酵素，植物酵素又分为果蔬酵素如苹果酵素、葡萄酵素等，植物干制品制得的酵素如红枣酵素、枸杞酵素等，动物酵素如阿胶酵素、鱼蛋白酵素，菌类酵素如银耳酵素、蛹虫草酵素等[2]。

葛根茯苓酵素是以葛根、茯苓、罗汉果、龙眼肉、红枣、枸杞子、甘草等药食同源中药材为原料，通过水提后经乳酸菌、酵母和醋酸菌等可食用菌种复合发酵而成的一款植物饮料，经人群长期食用和相关文献证明，具有解酒护肝、解油腻、润肠通便的作用[3]。

葛根茯苓酵素在生产过程中会依照酒、醋等发酵产品一样，发酵完毕后进行一定时间的陈放再灌装进行销售[4]，陈放后的酵素气味更加浓郁，口感更加柔和，但陈放对酵素的化学成分影响如何，尚未见相关研究报道。

葛根茯苓酵素为中药材复方，其成分复杂，经微生物转化后复杂程度更高，采用传统的分离、提取、纯化后再鉴定的方法来分析其成分耗时耗力，且难以发现其中痕量成分。近年来，色谱质谱联用技术的发展，LC-MS技术已成为鉴定未知化合物的有效手段[5]。高分辨质谱可以提供化合物的准确分子量，根据化合物的多级质谱信息、保留时间结合相应的文献和化合物数据库，可以快速鉴定出溶液中的成分。试验使用LC-MS对不同陈放时间的葛根茯苓酵素的化学成分进行比较分析，以期揭示陈放对葛根茯苓酵素化学成分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根茯苓酵素（江西仁仁健康产业有限公司）。乙腈（ACN，质谱纯，德国Merck公司）；甲酸（FA，色谱纯，美国Acros公司）。

1.2 仪器与设备

色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，Hypersi Gold aQ）；色谱仪（赛默飞，UltiMate 3000 UHPLC）；质谱仪（赛默飞，Q Exactive Focus）。

数据处理软件：Compound Discoverer，MassFrontier，Trace Finder。

数据库：中药成分数据库，mzCloud，Chem Spider。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

样品经0.2 μm滤膜过滤进样分析，进样量5 μL，紫外检测器波长254 nm；色谱柱Hypersi Gold aQ（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），进样室温度10 ℃，柱温30 ℃；流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B为0.1%的甲酸水溶液，洗脱条件：0～42 min，100% B；42～48 min，5% B；48～51 min，100% B。

1.3.2 质谱条件

离子源为HESI源，正负离子检测模式，鞘气流速设定40 arb，辅助气流速10 arb；喷雾电压3 500/3 200 V；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z100～1 500，50～750。MS/MS模式时，碰撞能40 eV。

2 结果与分析

2016年份和2018年份的葛根茯苓酵素的紫外色谱图见图1和图2，正负离子同时采集谱图分别见图3和图4。如图1和图2所示，因酵素中成分复杂，各峰之间的分离度相对来说较差。

图2 2018年份葛根茯苓酵素紫外色谱图

图3 2016年份葛根茯苓酵素正负离子同时采集谱图

图4 2016年份葛根茯苓酵素正负离子同时采集谱图

根据LC-MS结果与数据库比对，2个年份检出的成分如表1所示。

根据数据库匹配，2个年份的葛根茯苓酵素共检出171种物质，推测物质如表1所示。这些物质种类繁多，有黄酮类、氨基酸及其衍生物类、生物碱类、有机酸类、酯类、含氮类、醛酮类、还有脂肪类等，表明该葛根茯苓酵素成分复杂，各种来源于原料的成分和发酵所产生的初级代谢产物众多。这些物质中，数量最多的为有机酸类，这与酵素为发酵产物，主要代谢产物为有机酸相符，其后依次为黄酮类和氨基酸及其衍生物。

表1 2016和2018年份葛根茯苓酵素检出的成分及其峰面积

在2016年份和2018年份峰面积占比超过1%的物质有大豆素、DL-4-羟基苯乳酸、2-异丙基苹果酸、2-羟基己酸、3-苯基乳酸、琥珀酸、3-羟基-3-甲基甘氨酸、5-羟甲基-2-糠醛、2-羟基-2-甲基丁酸、惕格酸、L-苏氨酸、苹果酸、DL-乳酸、α-羟基戊二酸、戊烯二酸。由表2可知，2016年份的含量最多的3种主要成分分别为乳酸、琥珀酸和惕格酸，2018年份的为DL-乳酸、琥珀酸和3-苯基乳酸。相比较而言，2018年份中检出的物质更多，在2016年份中检出的而2018年份中未检出的有6种，而在2018年份中检出而2016年份中未检出的有19种。对比2个年份酵素的物质总体含量，其主要成分相似，微量成分略有差异。

表2 2016和2018年份酵素中成分种类

接表1

3 结论

酒、醋等在陈酿过程中，其所含成分会发生一定变化，如酒中的醇酸反应生产酯使酒的陈酿香气更加浓郁，酒中的乙醇分子重排使酒的口感变得更柔和[6]。酵素在陈放过程中风味会发生一定的变化，刺激性气味减弱，口感变得柔和，但根据质谱分析结果，2个不同年份的葛根茯苓酵素主要成分基本相同，仅在微量成分上具有一定差异。因此该风味上的变化可能是微量成分所致，或者发酵中所发生的并非化学变化，仅为物理变化。

葛根茯苓酵素因其为复方，通过LC-MS检测发现，该酵素含有非常多的有机物成分，这些有机成分有些是来自于中药材本身，有些是中药材成分在经过微生物的转化后产生，有些是微生物新产生的代谢产物，如各种有机酸、氨基酸等[7]，通过这些成分的共同作用，产生抗氧化、促进消化，改善肠道微生态等功效，对身体有比较高的保健价值。随着近年来我国酵素产业的发展，以及我国中医药行业的深入发掘，中药材草本酵素具有较大的发展空间，对于草本酵素的研究也会更加深入。