亚硝酸钠对鲅鱼鱼肉组织及肌原纤维蛋白结构的影响

郝子娜，张古龍，马雅楠，冯静，李宗泽

1.锦州医科大学食品科学与工程学院（锦州 121000）；2.锦州医科大学基础医学院（锦州 121000）

腌制水产品是一种传统的加工保藏产品，其风味独特，深受大众的青睐[1]。而腌制用盐一般为粗盐（含有亚硝酸钠），并且亚硝酸钠作为一种常用的食品添加剂，常被作为发色剂、防腐剂和抗氧化剂人为添加到食品中（发色、抑菌、抗氧化、改善风味和改善品质）。

国内外对于亚硝酸盐在腌制水产品方面的研究集中于亚硝酸盐与和胺反应生成产物亚硝基化合物对人体的危害[2-4]、对亚硝酸盐含量检测方法的优化[5-7]，以及亚硝酸盐的发色、抑菌等机理的研究[8-9]。而水产品蛋白质含量丰富，研究表明，亚硝酸盐对腌制水产品中蛋白质的作用主要机制是亚硝酸盐在酸性条件下生成亚硝酸，亚硝酸极不稳定，能够分解出NO，NO与蛋白质反应进而影响蛋白质的结构和功能[10]。Villaverde等对亚硝酸钠影响蛋白质氧化方面进行研究，结果发现与75 mg/kg亚硝酸钠相比，150 mg/kg亚硝酸钠能够显著促进干腌香肠中蛋白质的羰基化，从而促进了蛋白质氧化[11]。然而，Feng等[12]研究发现，亚硝酸钠既有抗氧化作用，又具有促氧化作用。NaNO2对蛋白质氧化的抗氧化作用表现为显著降低羰基含量、提高游离胺含量和降低表面疏水性。NaNO2对蛋白质氧化的促氧化作用是巯基的减少和二硫键的增加。因此，对于亚硝酸钠促进或抑制蛋白氧化仍没有统一结论。

国内对肉制品亚硝酸钠的最高限量多为150 mg/kg[13]。在国外，如美国、欧盟，也允许亚硝酸钠使用在肉制品中。Bedale等[14]研究表明，高浓度的亚硝酸盐会与DNA发生反应，导致DNA突变，给人类健康带来潜在的危害。因此，试验以鲅鱼为研究对象，系统研究浓度在150 mg/L以下的亚硝酸钠溶液对鲅鱼鱼肉组织及肌原纤维蛋白结构的影响包括鱼肉组织学特性、蛋白抽提率、蛋白组分、蛋白总巯基含量、蛋白羰基含量、蛋白表面疏水性等指标，阐明亚硝酸钠对鲅鱼鱼肉组织及肌原纤维蛋白的影响，为亚硝酸钠在腌制水产品中的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲅鱼（Scomberomorus niphonius，购自锦州水产品市场）；NaCl、MgCl2、HCl、NaNO2、甘氨酸、SDS、疏基乙醇、甘油、KCl、尿素、溴酚蓝、EDTA、DTNB、1-苯胺基-8萘基磺酸盐（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，分析纯，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

GL-25MS冷冻离心机（上海卢湘仪仪器有限公司）；FC酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；Bio-Rad电泳仪（美国伯乐公司）；MJ-WBL2521H匀浆机（中国美的集团股份有限公司）；TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；F4600荧光分光光度计（日立集团）；BX41光学显微镜（日本Olympus光学仪器有限公司）；AUW320分析天平（日本岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取

肌原纤维蛋白的提取方法参考Toldra等[15]的方法并略有修改。取5 g背部鱼肉，加10倍体积的溶液A（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），匀浆（10 000 r/min，1 min），匀浆液在冷冻离心机中离心（7 000 r/min，15 min），去除上清液，沉淀加10倍体积溶液A，匀浆，冷冻离心，去除上清液。所得沉淀加入10倍体积溶液B（0.45 mol/L KCl，15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），匀浆（10 000 r/min，1 min），匀浆液冷冻离心，取上清液，再次离心，取上清液得肌原纤维蛋白。此过程在4 ℃下进行。

1.3.2 对肌原纤维蛋白进行亚硝酸钠处理

在上述蛋白溶液中添加亚硝酸钠，使亚硝酸钠最终浓度分别为0，20，40，100和150 mg/L，并在25 ℃水浴下处理1 h后离心，取上清液为肌原纤维蛋白溶液继续试验。

1.3.3 肌原纤维蛋白溶解度的测定

肌原纤维蛋白溶液的蛋白溶解度用考马斯亮蓝染料结合比色法[16]测定。

1.3.4 电泳分析

采用Laemmli[17]的方法，分离胶浓度15%，浓缩胶浓度5%。蛋白上样量为10 μg。

1.3.5 巯基含量的测定

参照Ellman[18]的方法测定蛋白质的总巯基含量，并略有改动。取0.5 mL蛋白溶液，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（0.6 mol/L NaCl，6 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0）混匀。加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）混合均匀。将该反应体系放入40 ℃水浴锅中反应0.5 h，在412 nm处测定吸光度。巯基浓度用摩尔消光系数13 600 L/mol·cm计算。

1.3.6 羰基含量的测定

羰基含量的测定按照Oliver等[19]的方法并略加改动。取0.3 mL蛋白溶液，加入0.3 mL 10 mmol/L 2, 4-二硝基苯肼（DNPH），室温放置1 h，每隔10 min振荡1次。反应结束后，加入20%三氯乙酸0.6 mL，离心（9 000 r/min，15 min），离心后静置10 min，沉淀用2 mL乙醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗涤后加入2 mL 6 mol/L的盐酸胍溶液，振荡后37 ℃孵育20 min，离心15 min（9 000 r/min），静置10 min后取上清液，在367 nm处测其吸光度。使用分子吸光系数22 000 L/mol·cm计算羰基含量。

1.3.7 蛋白表面疏水性的测定

测定蛋白表面疏水性采用Cardamone等[20]的ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）荧光探针法，并略有改动。蛋白液用蛋白提取时使用的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）稀释成5个梯度浓度的蛋白溶液（质量浓度在0.05～10 mg/mL）。取2 mL蛋白液加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液，迅速振荡混匀后在暗室中静置3 min使其充分反应，测定样品的荧光强度。激发波长390 nm，发射波长470 nm，以样品的荧光强度对蛋白质浓度作图，曲线的初始斜率即为蛋白质分子表面疏水性指数。

1.3.8 鱼肉组织学特性的测定

按照李新等[21]的方法，并做了修改。将鱼肉切成3 cm×3 cm×2 cm小块后，在25 ℃分别用0，20，40，100和150 mg/L亚硝酸钠溶液处理1 h，样品被切成5 mm×5 mm×5 mm的小块，固定在4%的多聚甲醛溶液中24 h后，用梯度乙醚溶液（75%～100%，V/V）进行脱水处理。将样品包埋在石蜡中，采用光学显微镜进行观察，扫描图像放大倍数调整为1 500。

1.3.9 数据处理

整体试验重复3次，所得数据采用SPSS进行重复测量的方差分析及显著性分析，采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸钠对肌原纤维蛋白溶解度的影响

蛋白溶解度能够反映蛋白变性和聚集状态，同时也是衡量蛋白质功能的一个很好的指标[22]。肌原纤维蛋白溶解度如图1所示。

图1 不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白溶解度的影响

结果表明，亚硝酸钠的处理导致鲅鱼肌原纤维蛋白溶解度下降。未处理的新鲜鲅鱼肌原纤维蛋白溶解度为5.69 mg/mL，随着亚硝酸钠浓度的提高，鱼肉肌原纤维蛋白的溶解度逐渐下降。20 mg/L亚硝酸钠处理的鱼肉与对照组相比，蛋白溶解度没有显著性变化（P＞0.05），原因可能是由于亚硝酸钠浓度过低，蛋白变性并不明显。40 mg/L亚硝酸钠以上浓度处理的鱼肉，蛋白溶解度发生显著变化（P＜0.05），40 mg/L、100 mg/L和150 mg/L亚硝酸钠处理后的蛋白溶解度依次下降13.53%，20.91%和25.83%。研究表明，蛋白构象改变是引起蛋白溶解度变化的一个重要原因[23]。因此试验中肌原纤维蛋白溶解度的下降原因可能由于亚硝酸钠的处理导致肌原纤维蛋白构象发生变化，形成不溶性聚集体，并且亚硝酸钠浓度越高，导致蛋白质变性程度越高，从而导致蛋白质溶解度随之发生改变。

2.2 SDS-PAGE电泳分析

聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）可用于评价在不同加工处理后蛋白质的组分变化情况[18]。肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、肌原蛋白和肌原球蛋白等[24]。经过不同处理所得的鲅鱼鱼肉肌原纤维蛋白聚丙烯酰胺电泳结果见图2。

图2 不同浓度亚硝酸钠处理的肌原纤维蛋白电泳图谱

结果表明，肌球蛋白重链和副肌球蛋白组分随着亚硝酸钠浓度的增大而逐渐降低。45～116 kDa之间的蛋白条带随着亚硝酸钠浓度的增大而逐渐降低直至消失。其原因可能是亚硝酸钠处理后鱼肉部分蛋白发生变性，导致部分蛋白成为不可溶蛋白，因此使电泳条带变细或消失。然而45 kDa以下的蛋白组分含量处理前后并无明显变化，说明NaNO2处理对45 kDa以下的蛋白无明显影响。

2.3 亚硝酸钠对肌原纤维蛋白巯基含量的影响

蛋白总巯基含量的变化能够影响蛋白质结构的稳定性、易变性及酶的催化作用[25]。不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白总巯基含量的影响如图3所示。

图3 不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白总巯基含量的影响

结果表明，肌原纤维蛋白总巯基含量随着亚硝酸钠浓度的增大而显著性降低（P＜0.05）。与对照组相比，经过20 mg/L亚硝酸钠处理的鱼肉总巯基含量下降6.82%，下降程度不高，而随着亚硝酸钠浓度增加，40 mg/L及更高浓度亚硝酸钠处理后鱼肉总巯基含量发生急剧下降，与对照组相比，40 mg/L亚硝酸钠处理后鱼肉总巯基含量下降40.33%，而100 mg/L亚硝酸钠处理后鱼肉总巯基含量下降47.08%，150 mg/L亚硝酸钠处理后鱼肉总巯基含量下降55.95%。肌原纤维蛋白总巯基含量的下降是由于暴露在蛋白质表面的活性巯基中的半胱氨酸残基发生氧化，生成二硫键形成分子内或分子间交联导致[26]。由此可知，亚硝酸钠能够引起含硫氨基酸的蛋白质发生氧化。蛋白质的部分巯基形成二硫键，不仅使总巯基含量下降，而且改变蛋白质的空间结构[27]，从而影响蛋白的溶解度和聚集程度，这与前2个试验指标结果一致。

2.4 亚硝酸钠对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

蛋白质中的羰基含量是反映蛋白质氧化程度的重要指标之一[28]，羰基主要由氨基酸侧链（通常为带有—NH或者—NH2的氨基酸残基）及肽键的氧化断裂产生[29]。亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白羰基含量的影响如图4所示。

图4 不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

结果表明，20，40和100 mg/L亚硝酸钠处理后肌原纤维蛋白羰基含量虽有波动，但与对照组相比并没有显著性差异（P＞0.05），这表明低浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白并没有明显的促进或抑制氧化的作用。而150 mg/L亚硝酸钠处理后肌原纤维蛋白羰基含量与对照组相比略有升高（P＜0.05），这表明150 mg/L的亚硝酸处理能够加速鱼肉肌原纤维蛋白的氧化进程。马国源[30]研究发现低浓度亚硝酸钠能够促进鸡肉肌红蛋白的氧化，这与试验结果相似。但其研究发现低浓度亚硝酸钠却降低牦牛肉肌红蛋白羰基含量，马国源认为这与牦牛肉和鸡肉肌红蛋白含量及亚硝酸钠作用位点的差异有关。因此，低浓度亚硝酸钠能够促进鲅鱼肌原纤维蛋白的氧化进程，分析其原因，也可能与亚硝酸钠对肌原纤维蛋白的作用位点有关。

2.5 亚硝酸钠对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响如图5所示。

图5 不同浓度亚硝酸钠处理对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

结果表明，20 mg/L亚硝酸钠处理后肌原纤维蛋白表面疏水性与对照组相比并没有显著性差异（P＞0.05），40 mg/L及以上浓度的亚硝酸钠处理后，肌原纤维蛋白表面疏水性发生了显著性升高（P＜0.05），并且亚硝酸钠浓度越高，升高幅度越大。蛋白质表面疏水性的升高表明亚硝酸钠可以促使蛋白疏水性基团的暴露。被亚硝酸钠处理后的鲅鱼肌原纤维蛋白的表面疏水性比对照组高，这说明亚硝酸钠促进鱼肉肌原纤维蛋白氧化。

2.6 亚硝酸钠对鲅鱼肌肉微观组织的影响

经过亚硝酸钠处理后鱼肉肌肉微观组织如图6所示。

图6 不同浓度亚硝酸钠处理对鱼肉肌肉微观组织的影响

结果表明，对照组鲅鱼肌纤维排列紧密度较高，肌纤维间的间隙比较紧密。随着亚硝酸钠浓度增大，鲅鱼鱼肉微观组织整体形态与对照组相比肌纤维间隙有增高趋势但并不明显，鲅鱼鱼肉微观组织整体形态仍较为完整。鱼肉肌纤维增大能够导致鱼肉水分流失，致使鱼肉剪切力下降[31]。因此，用低浓度亚硝酸钠处理鱼肉会导致鱼肉水分部分少量流失，但对鱼肉整体组织状态作用不明显。

3 结论

试验对亚硝酸钠处理后鲅鱼鱼肉微观组织及肌原纤维蛋白结构进行研究。结果表明：亚硝酸钠对鲅鱼肌原纤维蛋白结构影响较显著，但对鱼肉微观组织影响并不明显，亚硝酸钠能够导致鲅鱼肌原纤维蛋白溶解度下降，45 kDa以上蛋白组分减少，表明蛋白发生聚集；总巯基含量和表面疏水性明显下降，羰基含量呈下降趋势，表明蛋白氧化受到抑制；鱼肉肌纤维间的间隙略有增大，但并不明显，表明150 mg/L亚硝酸钠对鱼肉整体组织状态作用不明显。