超声波萃取苦荬菜叶中齐墩果酸的工艺优化
2022-11-28珠拉郝俊峰荣荣贾玉山王志军格根图
珠拉,郝俊峰,荣荣,贾玉山,王志军,格根图*
1.内蒙古农业大学,草原与资源环境学院/农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室(呼和浩特 010019);2.兴安盟林业和草原工作站(乌兰浩特 137400)
苦荬菜(Ixeris polycephalaCass),为菊科苦荬菜属一年生或多年生草本植物,在我国分布较广,种质资源也比较丰富[1-2]。苦荬菜抗旱、抗寒能力强[2],适应能力强[3],可在恶劣环境中生长。苦荬菜利用广泛,具有药用、饲用及食用价值等。研究发现,苦荬菜富含黄酮类、三萜类和北半萜内酯类,此外还有甾醇类、有机酸类、苯丙素类。齐墩果酸作为三萜类中含量较高的主要成分,具有减轻肝损伤、促进肝细胞的再生、保肝、护肝、抑菌等生物活性作用[4-5]。孙阳等[6]研究表明齐墩果酸可诱导细胞凋亡,起到抗肿瘤作用。而将齐墩果酸作为添加剂代替抗生素添加进饲料中,可以提高家畜的免疫力、应激能力及改善畜产品品质[7]。此外,苦荬菜茎叶鲜嫩多汁,粗蛋白质达20%以上,常作为家畜喜食的优质青绿饲料[8]。国内外的研究多集中于苦荬菜中黄酮类物质的提取[2,9-11]、纯化[12-13]、鉴定[1,14-15]与含量测定[9,16-18],而对具有多种生物活性的齐墩果酸的了解不够深入,仍需进一步研究。近年来,随着人们对养生的关注度逐渐加大,绿色、天然、营养、保健的食品日益受到青睐[19]。因此,加大对植源性活性物质的研究具有重要意义。
超声波提取法是比较普遍的活性物质提取方法,具有安全[20]、省时省力[21]、节约成本[22]、提取率高、有效物质破坏少的特点[23]。超声波提取法是通过热效应使细胞破裂,释放有效物质,从而达到提取效果[24]。试验以蒙早苦荬菜叶片为材料,通过超声波提取法,研究不同时间、温度、超声频率、料液比对蒙早苦荬菜叶中齐墩果酸提取量的影响,从而确定最佳提取工艺,旨在为苦荬菜的精深加工寻找新方向,也为进一步开发和利用齐墩果酸奠定理论基础。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
初花期蒙早苦荬菜叶(置于避光处室温阴干)。
甲醇(色谱级);齐墩果酸(上海源叶生物科技有限公司);其他均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
E2695-2489高效液相色谱紫外联用仪[沃特世科技(上海)有限公司];VOSHIN-1500C低温超声波萃取仪(无锡沃信仪器制造有限公司);SHB-3A循环水真空泵(郑州杜甫仪器厂)。
1.3 方法
1.3.1 蒙早苦荬菜叶齐墩果酸的提取
取1.00 g蒙早苦荬菜叶阴干样放入盛有体积分数70%乙醇溶液的具塞锥形瓶中,在一定功率和时间下进行超声波提取,提取液经离心(15 000 r/min,15 min)后,取上清液,用体积分数70%的乙醇溶液定容到50 mL,摇匀,备用。
1.3.2 色谱条件
色谱柱为Waters RP C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.1%磷酸(85∶15,V/V)等度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长210 nm,进样量10 μL[2]。标准品色谱图见图1(A),样品图见图1(B)。
图1 齐墩果酸高效液相色谱图
1.3.3 蒙早苦荬菜中齐墩果酸的测定
精密称取35.075 mg齐墩果酸于100 mL容量瓶中,用体积分数70%的甲醇溶液定容至刻度线,得质量浓度为35.8 μg/mL的标准品溶液。分别取2,4,6,8,10和12 mL于25 mL容量瓶中,用体积分数70%的甲醇溶液定容,得到质量浓度分别为28.06,56.12,84.18,112.24,140.3和168.36 μg/mL的对照品溶液。通过0.22 μm微孔滤膜,上机检测。以齐墩果酸质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线,得到线性回归方程y=11.386x+2 094.3(R2=0.999 9)。
精确量取2.5 mL样品溶液,过0.22 μm微孔滤膜,上机测定。按照得到的齐墩果酸标准曲线,计算样品提取液中齐墩果酸的质量浓度,每组平行3次,并按式(1)计算齐墩果酸的提取得率(mg/g)。
式中:C为蒙早苦荬菜叶齐墩果酸的质量浓度,μg/mL;V为提取液体积,mL;M为蒙早苦荬菜叶质量,g。
1.3.4 方法学考察
1.3.4.1 精密度试验
取1.3.3的对照品溶液,按1.3.2的色谱条件连续进样6针,记录出峰面积,计算齐墩果酸峰面积的SRSD值,结果为0.13%,说明仪器精密度较好。
1.3.4.2 重复性试验
取6份1.3.1的供试品溶液,按1.3.2的色谱条件进行测定,记录出峰面积,计算齐墩果酸的SRSD值,结果为0.61%,说明该方法重复性较好。
1.3.4.3 稳定性试验
取1.3.1的供试品溶液,在室温下静置0,2,4,8,12和24 h,按1.3.2的色谱条件进行测定,记录出峰面积,计算齐墩果酸的SRSD值,结果为0.86%,说明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
1.3.4.4 加样回收试验
取6份已知含量的蒙早苦荬菜叶粉末样品,每份称取2.5 g,加入适量齐墩果酸对照品,按1.3.1的方法提取,在1.3.2的色谱条件下进行测定,记录出峰面积,计算加标回收率。平均回收率为97.10%,SRSD为0.07%,说明该测定方法合理。
1.3.5 单因素试验
在一定条件下,分别考察提取时间(A)、提取温度(B)、超声频率(C)、料液比(D)对蒙早苦荬菜叶齐墩果酸得率的影响。
1.3.6 正交优化试验
基于单因素试验结论,选择提取时间、提取温度、超声频率、料液比4个因素为自变量(X),蒙早苦荬菜齐墩果酸得率为考察指标(Y),设计L9(34)正交试验,见表1。
表1 正交试验因素水平表
1.3.7 数据处理
使用Origin 2021软件进行数据绘图,使用SAS 9.4进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取时间对齐墩果酸得率的影响
以体积分数70%的乙醇作为提取液,固定料液比1∶10 g/mL、超声频率20 kHz、提取温度30 ℃,分别选择提取时间20,40,60和80 min进行试验。由图2可知,齐墩果酸得率在提取时间20~80 min范围内呈下降—上升—下降趋势。提取时间20 min时最高,随着提取时间延长,齐墩果酸得率呈现降低趋势,这可能是由于提取时间的延长,造成蒙早苦荬菜中其他醇溶性物质的溶解,从而影响齐墩果酸得率[18]。因此,选择提取时间20 min进行下一步正交优化试验。
图2 提取时间对齐墩果酸得率的影响
2.1.2 提取温度对齐墩果酸得率的影响
以体积分数70%的乙醇作为提取液,固定料液比1∶10 g/mL、超声频率20 kHz、提取时间20 min,分别选择提取温度30,40,50和60 ℃进行试验。由图3可知,齐墩果酸得率在提取温度40~70 ℃范围内呈急剧上升而后下降的趋势。提取温度60 ℃时达到峰值,之后呈现下降趋势。温度太高或太低均会对齐墩果酸得率产生不良影响。温度太高,可能会造成活性物质结构的破坏和降解,而温度太低会造成细胞破坏程度低,提取不够充分[18,25]。因此,选择提取温度60 ℃进行下一步正交优化试验。
图3 提取温度对齐墩果酸得率的影响
2.1.3 超声频率对齐墩果酸得率的影响
以体积分数70%的乙醇作为提取液,固定料液比1∶10 g/mL、超声温度30 ℃、提取时间20 min,分别选择超声频率40,60,80和100 kHz进行试验。由图4可知,齐墩果酸得率在超声频率40~100 kHz范围内呈先上升而后下降趋势。超声频率40~60 kHz时增长率最大,80 kHz时达到峰值,之后呈现下降趋势。因此,选择超声频率80 kHz进行下一步正交优化试验。
图4 超声频率对齐墩果酸得率的影响
2.1.4 料液比对齐墩果酸得率的影响
以体积分数70%的乙醇作为提取液,固定超声温度30 ℃、超声频率40 kHz、提取时间20 min,分别选择料液比1∶10,1∶20,1∶30和1∶40 g/mL进行试验。由图5可知,齐墩果酸得率在1∶10~1∶40 g/mL范围内呈急剧上升而后下降趋势。料液比1∶30 g/mL时达到峰值,随着料液比的增加,齐墩果酸得率呈下降趋势。料液比体现溶剂用量的大小。一般而言,溶剂用量越多,活性物质的提取效率越大。但料液比中溶剂用量增加到一定程度时,植物中的有效成分基本析出,得率也将不会增加。过量的乙醇造成有机溶剂的浪费[26]。因此,基于得率、溶剂用量的角度,选择料液比1∶30 g/mL进行下一步正交优化试验。
图5 料液比对齐墩果酸得率的影响
2.2 正交试验结果
根据单因素试验结果,选择提取时间、提取温度、超声频率、料液比4个因素,各因素设定3个水平,设计正交试验。正交试验结果见表2,方差分析见表3。
由表2的极差分析结果可知,各因素对齐墩果酸得率影响程度各不相同,主次顺序依次为D>A>B>C,即料液比对齐墩果酸得率的影响程度最大,其次为提取时间,超声频率的影响程度最小。根据K值,确定齐墩果酸的最佳提取条件A3B1C2D3,即提取时间60 min、提取温度50 ℃、超声频率80 kHz、料液比1∶40 g/mL。
表2 正交试验结果
为验证齐墩果酸提取工艺的可行性,在最佳提取工艺下,即提取时间60 min、提取温度50 ℃、超声频率80 kHz、料液比1∶40 g/mL,测定3次,得到蒙早苦荬菜叶中齐墩果酸的平均得率为28.88 mg/g,SRSD为1.03%,说明该方法可行。黄勤英等[27]研究表明在料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数95%、提取时间60 min和提取温度50 ℃条件下,苦丁茶中齐墩果酸的得率为11.86 mg/g(UV检测)。刘伟等[28]研究表明在料液比1∶15 g/mL、体积分数80%乙醇条件下,超声1 h,在温度60 ℃下回流1.5 h,沙棘中齐墩果酸的得率为0.875 mg/g(UV检测)。通过与苦丁茶和沙棘中的齐墩果酸得率对比发现,蒙早苦荬菜叶中齐墩果酸的得率较高,原因可能为试验所选的蒙早苦荬菜叶与苦丁茶和沙棘材料不同,因而植物体内所含齐墩果酸含量有所差异,也说明蒙早苦荬菜叶是齐墩果酸含量较高的植物,可以作为提取齐墩果酸的天然植物来源。另外,提取工艺也是所含齐墩果酸含量差异的一个原因[18],原料的预处理和检测方法不同也会造成齐墩果酸含量有所差异。
由表3可知,提取时间(A)、提取温度(B)和料液比(D)对蒙早苦荬菜叶中齐墩果酸的提取量均有极显著影响(P<0.01)。
表3 方差分析结果
3 结论
蒙早苦荬菜通过超声波提取法提取,并以单因素试验结果为基础做正交测验,各因素对苦荬菜齐墩果酸得率的影响程度为料液比>时间>温度>频率。根据K值,最佳提取条件为A3B1C2D3,即提取时间60 min、提取温度50 ℃、超声频率80 kHz、料液比1∶40 g/mL,在此条件下齐墩果酸的提取量为28.88 mg/g。试验结果为齐墩果酸的提取及应用提供依据。