响应面法优化余甘子果渣没食子酸的提取工艺

孟晓，唐鸣跃，袁昌益，刘秋妍，王娟，蒋丽施

成都中医药大学公共卫生学院（成都 611137）

余甘子，为大戟科叶下珠属植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的果实，主要生长于亚洲的热带或亚热带地区，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳的功效[1-2]，也是具有特色的药食同源品种与经济作物。现代大量研究证明，余甘子具有大量的多酚、黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分，并具有预防肿瘤、降血脂、降血糖、抗菌消炎及其他多种人体特殊的生理功能[3-5]。余甘子中的主要药用生理活性物质成分中又以没食子酸含量居多，研究已证明没食子酸确实具有天然抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤等特殊功能作用[6-8]，被广泛应用于各种药品、保健品、食品、食品添加剂生产等行业[9-10]。

提取没食子酸常见的方法有离子萃取法、回流法、浸渍法、酸碱水解法等[11-13]。其中：回流法、浸渍法的提取时间一般较长，且生产成本较高；离子萃取法生产成本低，但温度较高，对产物的活性有影响；酸水解法、碱水解法可得到大量没食子酸，提取率高，但二者提取工艺复杂，工业化生产成本较高；与其他方法相比，水提法使用的设备成本低、操作简便、安全系数高、适应工业化生产[11]。

以余甘子果渣对研究对象，采用水提法，通过单因素试验和响应面试验设计，优化余甘子果渣没食子酸提取的最佳工艺条件，为余甘子及其副产物的综合开发利用提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜余甘子（市售）；没食子酸标准品（中国食品药品检定研究院）；福林酚、无水碳酸钠（分析纯）。

1.2 仪器与设备

JD300-3分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；L2S可见光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DHG-9240 电热恒温鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺

新鲜余甘子榨汁→过滤后得滤渣→称取果渣移入锥形瓶中→加入蒸馏水→水浴锅浸提→抽滤→滤液回收→蒸馏水定容→以蒸馏水为参比液测吸光度

1.3.2 没食子酸的测定

1.3.2.1 没食子酸标准曲线的制作

称取25 mg没食子酸标准品，用蒸馏水溶化，定容至250 mL容量瓶中，调配成质量浓度0.1 mg/mL的标准品溶液。用移液管依次吸取0，1，2，3，4和5 mL标准溶液于50 mL棕色容量瓶中，分别加入1 ml福林酚混合，静置5 min，再分别加入2 mL的15%碳酸钠溶液，充分混合后定容，配成终质量浓度依次为0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL的对照品溶液，以空白样做参比，并于760 nm测其吸光度，反复测量3次，参照式（1）进行计算[14]。

1.3.2.2 没食子酸提取率的计算

式中：A0为样品吸光度；V为样品滤液定容后的体积，mL；m为样品的质量，g；Q为稀释倍数。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取时间对提取率的影响

在提取温度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取2次条件下，研究不同提取时间（30，40，50，60和70 min）对余甘子果渣没食子酸提取率的影响。

1.3.3.2 提取温度对提取率的影响

在提取时间60 min、料液比1∶30（g/mL）、提取2次条件下，研究不同提取温度（60，70，80，90和100 ℃）对余甘子果渣没食子酸提取率的影响。

1.3.3.3 料液比对提取率的影响

在提取温度80 ℃、提取时间60 min、提取2次条件下，研究不同料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）对余甘子果渣没食子酸提取率的影响。

1.3.3.4 提取次数对提取率的影响

在提取温度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取时间60 min条件下，研究不同提取次数（1，2，3，4和5次）对余甘子果渣没食子酸提取率的影响。

1.3.4 响应面优化

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 12.0软件进行Box-Behnken试验设计。以提取温度、提取时间及料液比为考察对象，以没食子酸提取率为指标进行试验设计，其因素水平见表1。

表1 响应面试验因子水平

1.4 数据处理与统计分析

从余甘子果渣中提取没食子酸的单因素试验重复3次，取平均值。使用 Microsoft Office Excel 2013处理试验数据。采用SPSS 25.0和Design-Expert 12.0数据处理系统进行统计分析。其中，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由图1可以得到，以吸光度为纵坐标，以标准品质量浓度为横坐标，对其做线性回归得出标准曲线方程y=109.97x+0.006 8，相关系数为R2=0.999 2，表明在0.000～0.010 mg/mL的范围内，线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 不同提取次数对余甘子果渣没食子酸提取率的影响

从图2可知，提取次数从1次增加到2次，余甘子果渣没食子酸的提取率明显升高，提取次数为2次时，与提取1次相比余甘子果渣没食子酸提取率有显著差异（P＜0.05），为3.49%±0.20%，但是提取2次后提取次数的增加对没食子酸提取率无显著影响（P＞0.05），说明余甘子果渣中的没食子酸2次基本提取完毕，考虑到成本、耗时等综合因素，确定余甘子果渣没食子酸的最佳提取次数为2次。

图2 提取次数对没食子酸提取率的影响

2.2.2 不同提取时间对余甘子果渣没食子酸提取率的影响

从图3可知，随着提取时间从30 min延长到60 min，余甘子果渣的没食子酸提取率逐渐增加。提取时间为60 min时，与提取时间50 min时相比，其提取率显著升高（P＜0.05），为3.18%±0.03%。但是，60 min后，继续延长提取时间，余甘子果渣的没食子酸提取率出现显著下降趋势（P＜0.05）。原因可能是提取时间过短时没食子酸未能充分溶出，随着提取时间的延长，没食子酸溶解充分，提取率升高。60 min之后提取时间进一步增加，没食子酸结构可能被分解破坏，造成提取率降低[15]。因此，余甘子果渣没食子酸的最佳提取时间为60 min。

图3 提取时间对没食子酸提取率的影响

2.2.3 不同提取温度对余甘子果渣没食子酸提取率的影响

从图4可知，提取温度在60 ℃时没食子酸提取率最低，随着提取温度逐渐增加，没食子酸提取率不断升高，提取温度在90 ℃时没食子酸提取率达到最大。余甘子主要含多酚类物质，其中可水解鞣质能够受酸、碱等催化而水解，加热过程中，由于多酚等物质的作用，提取物处于酸性状态，连续加热后发生水解反应，从而生成没食子酸使得没食子酸含量上升，提取率增高[15]。因此，余甘子果渣没食子酸的最佳提取温度为90 ℃。

图4 提取温度对没食子酸提取率的影响

2.2.4 不同料液比对余甘子果渣没食子酸提取率的影响

从图5可知，料液比从1∶20（g/mL）变化到1∶50（g/mL），余甘子果渣的没食子酸提取率由下降转为逐渐增加，料液比1∶50（g/mL）时，与料液比1∶60（g/mL）相比提取率有显著差异（P＜0.05），该条件下余甘子果渣的没食子酸提取率最高，为3.78%±0.05%。原因可能是随着液体占比的增大，没食子酸溶出，当液体占比过大时，溶剂过多，没食子酸的溶出已达极限，其他物质溶解增多，没食子酸提取率降低[16]。因此，余甘子果渣没食子酸的最佳提取料液比为1∶50（g/mL）。

图5 料液比对没食子酸提取率的影响

2.3 响应面试验

基于单因素试验结果，根据Box-Behnken中心组合设计三因素三水平的响应面分析试验。根据表1中的因素和水平设计试验方案。响应面的试验设计和结果如表2所示。

表2 响应面试验设计和结果

将表2中的数据运用Design Expert软件做回归拟合，得到以余甘子果渣没食子酸提取率（Y）为响应值的目标函数：Y=3.84+0.096 3A-0.031 2B+0.100C+0.030 0AB+0.017 5AC-0.002 5BC-0.277 0A2-0.082 0B2-0.029 5C2。

回归模型方差分析见表3。利用方差分析结果建立的回归模型P＜0.000 1，达到极显著水平，得出R2=0.986 7，Radj2=0.969 7，结果表明，该模型可以较好地反映响应值的变化。失拟项（P=0.705 5）不显著，表明回归模型和预测值之间有较好的拟合度。

表3 回归模型方差分析

通过料液比、提取时间、提取温度的试验设计优化，得到相应的数据分析。二次方程回归系数的显著性表明，因素A提取温度（P＜0.010）对余甘子果渣没食子酸提取影响极显著，因素B提取时间（P＜0.050）对余甘子果渣没食子酸提取影响显著；交互项对余甘子果渣没食子酸提取影响均不显著；二次项A2、B2（P＜0.010）对余甘子果渣没食子酸提取影响极显著。各因素对从余甘子果渣中提取没食子酸的影响顺序：提取温度二次项=提取温度一次项＞提取时间二次项＞提取时间一次项＞料液比二次项＞提取时间和提取温度交互项＞料液比和提取温度交互项＞料液比一次项＞料液比和提取时间交互项。

图7 提取温度和料液比对没食子酸提取率影响的响应面及等高线

根据回归模型作出相应的响应面及等高线，从各个因素交互作用对响应面进行分析，从图6～图8可知，提取温度与提取时间的交互作用对余甘子果渣没食子酸提取的影响最显著。

图6 提取温度和提取时间对没食子酸提取率影响的响应面及等高线

图8 提取时间和料液比对没食子酸提取率影响的响应面及等高线

2.4 最佳工艺条件试验验证

为验证回归模型的预测值与试验的真实值之间的拟合程度，采用余甘子果渣没食子酸的提取率验证响应因素。考虑到试验的可操作性，选择响应因子：提取温度91 ℃、提取时间59 min、料液比1∶51（g/mL）。在该条件下进行3组平行试验，没食子酸平均提取率为3.84%，与回归模型预测值（3.86%）相比，相对误差小于0.01%。因此，通过响应面法优化得到的余甘子果渣没食子酸最佳提取工艺条件的回归模型符合实际。

3 结论

以余甘子果渣为研究对象，采用水提法提取余甘子果渣中的没食子酸，通过单因素试验和响应面优化试验进行分析研究，得出最优提取条件：提取2次、提取温度91 ℃、提取时间59 min、料液比1∶51（g/mL）。在该条件下，余甘子果渣没食子酸的提取率可达3.84%±0.01%。试验结果可为余甘子果渣没食子酸提取工艺的工业化应用提供参数借鉴。

4 讨论

国内外研究主要集中在余甘子提取物的生理活性、药理作用等方面[17-18]，对余甘子没食子酸的提取大多采用超声、回流、离子萃取法等，采用水提法对余甘子果渣中没食子酸的提取研究较少。

水提法是传统的提取方法，唐远江等[19]在加33.5倍水、90 ℃下回流提取4.2 h、提取2次的条件下提取地榆中的没食子酸，经真空浓缩后，其提取率可达4.21%，试验的提取温度与其研究的提取温度基本一致，90 ℃的高温有利于没食子酸的溶解，但其提取时间更长，有利于一系列水解反应生成更多的没食子酸，而试验提取工艺较简单，提取时间较短，余甘子中的单宁酸类物质未完全转化成没食子酸。吴春燕[20]采用离子萃取法，从芒果叶中提取没食子酸，在提取温度100 ℃、NaHCO3浓度0.16%、溶剂倍量90 mL/g、浸提60 min条件下，没食子酸的提取率为1.74%；赵仕花等[21]使用超声辅助提取芒果皮中的没食子酸，在超声频率20 kHz、超声波输出功率350 W、乙醇体积分数30%、浸提时间70 min、浸提温度50 ℃及料液比1∶40（g/mL）的条件下，没食子酸提取率为2.42%。离子萃取法和超声辅助提取法均利于有效成分的析出，减少浸提时间，也增加产物的提取率，但对芒果废弃物中没食子酸的提取来说，提取效率并不高，且二者研究的提取率均不及试验的提取率高，这或许与试验研究的对象差异有关。研究表明，芒果叶中没食子酸含量为0.23%[22]，芒果核仁中没食子酸含量为2.45%[23]，相比芒果废弃物中的没食子酸而言，余甘子果渣中没食子酸的含量更高，余甘子大部分有效成分主要集中在果肉，果核中脂肪酸类成分占比较高[24]，但仍含有一定量的鞣质、酚酸等功能性成分。试验操作更简便，材料易得，效率更高。

与酸、碱水解等其他提取没食子酸的方法相比，得到的没食子酸提取率较低，但试验采用水提法提取余甘子果渣中的没食子酸，以水为溶剂，廉价易得，使用安全，没有化学污染，得到的没食子酸在安全性上有保障，可用于食品、药品、化妆品和食品添加剂等行业。另外，余甘子果渣作为废弃物，极易发生褐变反应。余甘子酶促褐变以没食子酸为底物，经多酚氧化酶等酶氧化，形成褐变物质[25]。随着果渣贮存时间的变化，没食子酸提取率也有明显变化，因此，在实际工业生产中可进一步优化果渣的贮存条件，以提高没食子酸提取率。