内质网分子伴侣GRP94对伪狂犬病毒增殖的调节作用

倪敏舒，陈 丽，鲍 熹，徐 悦，庄腾寒，冯 磊，3，4，*

(1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013； 2.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014； 3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009； 4.江苏省食品质量安全重点实验室 省部共建国家重点实验室培育基地，江苏 南京 210014)

伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)又名奥叶兹基氏病病毒(Aujeszky’sdiseasevirus，ADV)，是一种猪疱疹病毒。PRV遗传物质为线性双链DNA基因组，包裹在二十面体的衣壳内形成核衣壳，衣壳嵌入一种称为被膜的蛋白质基质中，外部再包裹一层含多种糖蛋白的病毒囊膜。定位于病毒囊膜上的糖蛋白包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN等。PRV入侵细胞和增殖过程中会导致感染细胞产生应激反应。研究表明，病毒或许会通过调控应激反应使自身增殖受益[1-2]，内质网应激(ER stress)就是其中一种重要机制。病毒蛋白在内质网中大量表达，破坏内质网平衡，导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网中迅速积累，内质网面临巨大压力，随后细胞处于应激状态[3]。未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)是细胞为了恢复内质网稳态所做出的适应性反应。通过内质网分子伴侣蛋白与UPR 3个传感分子断开连接，随后激活相应3条反应通路[4-5]。这3条通路分别以促进蛋白质折叠、抑制蛋白质合成和增强内质网相关降解的方式缓解内质网应激[6-8]。内质网分子伴侣主要负责协助蛋白质折叠、装配和运输，且不参与目标蛋白的组成。分子伴侣包括热休克蛋白家族(GRP78、GRP94等)和多种钙结合蛋白[9]。在众多内质网分子伴侣中，GRP78、GRP94目前研究较多，在UPR中扮演关键角色。目前已发现，GRP78在内质网应激和病毒增殖中的重要作用，猪圆环病毒2型的eIF-2α去磷酸化过程被抑制后，PCV2的复制也明显被抑制，提示PCV2通过eIF-2α的去磷酸化恢复细胞翻译水平，加强自身增殖[10]。GRP94具有与GRP78相似的应激条件，它们都可以与错误折叠的蛋白质形成稳定复合物，以缓解内质网压力[9-11]。本研究探究了GRP94对PRV增殖的调节作用，进一步明确了GRP94在PRV感染过程的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株与载体

BHK-21细胞和PRV(gE-)种毒均由江苏省农业科学院动物免疫工程研究所保藏。质粒载体pCas9-IRES-eGFP、plenti-CMV-MCS-EF1α-eGFP、pUC-sgRNA-cloning均由国家兽用生物制品工程技术研究中心细胞工程实验室构建保存。经密码子优化和添加Kozak序列的GRP94编码序列克隆载体pUC57-GRP94由南京擎科公司构建合成。

1.2 设备

二氧化碳培养箱(Thermo)，-80 ℃超低温冰箱(Thermo)，倒置显微镜(OLYMPUS)，高、低速离心机(Eppendorf)，PCR仪(Biometra)，核酸电泳仪与全自动凝胶成像分析系统(Biometra)。

1.3 试剂

DMEM培养基、新生牛血清(newborn calf serum，NBS)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司；DNA连接酶和NheⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ内切酶购于Takara Bio有限公司；质粒DNA抽提试剂盒与转染试剂购于QIAGEN公司；使用的兔单克隆抗体如下：anti-GRP78、anti-GRP94、anti-flag购自Abcam公司；anti-p-eIF2α、anti-ATF6、anti-eIF2α购自CST公司；anti-GAPDH购自Proteintech公司；荧光标记羊抗兔IgG购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 GRP94的sgRNA识别位点设计

利用CRISPR在线设计工具对GRP94基因的外显子设计2对sgRNA，sgRNA序列信息见表1。引物经退火处理，与BbsⅠ酶切处理的pUC-sgRNA-cloning载体进行连接反应，克隆成功的pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2用于后续转染实验。

表1 sgRNA序列

1.5 BHK-21细胞的转染和分选单细胞克隆

含有1.2 μg的pCAS-IRES-Egfp、pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2与转染试剂混合形成转染复合物，转染BHK-21细胞。24 h后用流式细胞仪分选，将带有绿色荧光的细胞分选至96孔板中形成单细胞克隆，逐级扩大培养。

1.6 单细胞克隆鉴定

用刮刀刮取微量正常生长的单细胞克隆，提取细胞克隆基因组。针对GRP94基因序列设计鉴定引物，上游引物序列：5′-TACTGAGGGTCGTGAGCGTT-3′，下游引物序列：5′-AACGCTCACGACCCTCAGTA-3′。PCR反应程序：98 ℃ 10 min；98 ℃45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，30 个循环。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.7 慢病毒表达载体的构建、包装与阳性细胞的筛选

质粒pUC57-GRP94经过NotⅠ和NheⅠ双酶切后连接至plenti载体，获得plenti-CMV-GRP94-EF1α-eGFP。将plenti-CMV-GRP94-EF1α-eGFP、pMD2G、psPAX2质粒共转染293T细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱培育48 h后观察绿色荧光蛋白的表达水平，收集上清重组慢病毒液感染BHK-21细胞，培养24 h后观察BHK21细胞形态，48 h后更换新鲜培养基并且加入40 μg·mL-1嘌呤霉素进行药物筛选。待形成单个抗性集落后，提高嘌呤霉素作用浓度至最终质量浓度为120 μg·mL-1，获得GRP94基因过表达的重组BHK-21细胞株。

1.8 病毒滴度的测定

BHK-21细胞在96孔板培养48 h后，弃去上清，加入10倍连续梯度稀释的PRV病毒样品，每孔100 μL；于37 ℃、5.0%二氧化碳培养箱中培养。观察细胞病变过程，4 d后病变不再增多，记录最终结果，按Reed-Muench两氏法计算病毒滴度，结果以lg(TCID50)·mL-1表示。

1.9 蛋白免疫印迹反应

收集细胞，用PBS洗涤后用细胞裂解液在冰上裂解后离心取上清液，加5×蛋白上样缓冲液制成蛋白样。然后进行电泳、转膜，封闭后孵育一抗，4 ℃过夜，用TBS洗涤3次，每次10 min；孵育二抗，常温孵育2 h，TBS洗涤3次，每次10 min。用增强化学发光法(ECL)观察蛋白表达。

1.10 PRV糖蛋白瞬时表达

PRV的gB、gC、gD、gH、gI、gL、gM和gN蛋白编码序列由南京擎科生物科技有限公司合成。将各糖蛋白目的基因酶切后与pcDNA3.1(-)真核表达载体相连，构建8个重组表达质粒。按Lipofectamine TM 3000的说明书配制转染复合物转染至BHK-21细胞。24 h后去除细胞上清液，用刮刀刮下细胞，经PBS反复冲洗收集细胞沉淀，于-80 ℃冰箱保存，用于免疫印迹法检测PRV结构蛋白的重组表达与后续免疫共沉淀检测。

1.11 免疫共沉淀

收集目的细胞，用PBS缓冲液洗涤后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，充分混匀，冰上裂解15 min后，高速离心10 min，收集上清液。将抗体用TBS缓冲液稀释到推荐的稀释比例，配置抗体工作液，加入到事先经过适当洗涤的Protein A+G磁珠中，室温混合翻转孵育1 h，磁力架分离磁珠，TBS缓冲液轻吹重悬洗涤3次，每次5 min，用磁力架回收磁珠。将细胞裂解液加入事先结合了抗体的Protein A+G中，室温旋转孵育2 h。孵育结束后，磁力架分离10 s，去除上清液。直接向磁珠中加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min，磁力架分离10 s后取上清进行蛋白免疫印迹反应。

2 结果与分析

2.1 重组BHK-21-GRP94细胞的构建

如图1所示，含有GRP94完整表达盒的重组慢病毒感染BHK-21细胞，经嘌呤霉素筛选获得GRP94过表达的稳转细胞株，命名为BHK-21-GRP94。该细胞株生长旺盛，形态正常；与GRP94重组蛋白共表达的GFP荧光阳性率高，说明该GRP94基因过表达细胞株满足后续实验要求。

A，荧光场；B,自然光场。A， Fluorescence； B， Natural light.图1 GRP94基因过表达细胞形态Fig.1 Morphology of GRP94 overexpressing cell lines

2.2 BHK-21-GRP94-KO细胞的构建与鉴定

采用CRISPR/Cas9系统和流式细胞仪分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)获得GRP94蛋白编码序列敲除的备选BHK-21细胞克隆6株，经PCR鉴定，细胞克隆1和细胞克隆3的PCR扩增产物与BHK-21原始细胞相比小了2 797 bp(图2)。其中，克隆1的PCR产物测序结果如图3所示，BHK-21细胞的GRP94基因产生大片段敲除，缺失片段与所设计的sgRNA靶点相符。该单克隆细胞扩大培养并冻存保种，命名为BHK-21-GRP94-KO细胞。

泳道1～6，阳性细胞单克隆；泳道C，阴性细胞。Lane 1-6， PCR products from different single cell clones； Lane C， Negative cells.图2 细胞单克隆的PCR产物电泳鉴定Fig.2 PCR products of single cell clones

上方序列为泳道C回收测序结果；下方序列为泳道1回收测序结果。Upper sequence was PCR product sequence of lane C； Lower sequence was PCR product sequence of lane 1.图3 单克隆细胞PCR产物与GRP94基因序列的比对结果Fig.3 Comparison of GRP94 gene sequence with PCR product of single cell clones

2.3 不同BHK-21细胞的GRP94表达

以BHK-21原始细胞为对照，提取BHK-21-GRP94和BHK-21-GRP94-KO细胞的胞内总蛋白，用蛋白质免疫印迹法检测各细胞的GRP94表达水平。结果(图4)表明，BHK-21-GRP94中GRP94表达量显著高于BHK-21细胞，BHK-21-GRP94-KO细胞中的GRP94表达量显著下降。

*和**分别表示在P<0.1和P<0.05水平差异显著。下同。* and ** meant significant differences at the levels of P<0.1 and P<0.05， respectively. The same as below.图4 不同BHK-21细胞中GRP94的表达Fig.4 Detection of GRP94 expression in different BHK-21 cells

2.4 PRV在不同BHK-21细胞中的增殖比较

在BHK-21、BHK-21-GRP94和BHK-21-GRP94-KO细胞中分别感染PRV，病毒增殖结果如图5所示。结果表明，PRV病毒在BHK-21-GRP94细胞中增殖效价显著高于BHK-21细胞的病毒增殖效价，BHK-21-GRP94-KO细胞中PRV病毒增殖结果未见明显改变。

***表示在P<0.001水平差异显著。下同。*** meant significant difference at the level of P<0.001. The same as below.图5 不同细胞增殖PRV的毒价比较Fig.5 Viral titers of PRV cultured in different cells

2.5 GRP94蛋白对UPR通路的影响

为探索GRP94对PRV病毒感染细胞后产生ER应激的影响，利用蛋白免疫印迹检测感染PRV病毒后的3种BHK-21细胞内UPR相关蛋白的表达水平，结果如图6所示。以健康对照BHK-21细胞(Mock-infection)为阴性对照，TG处理的BHK-21细胞为阳性对照，PRV感染BHK-21细胞后，ER应激的标志分子GRP78表达水平与对照细胞相比显著提高；GRP94的表达水平也高于对照组。此外，eIF-2α转录因子的磷酸化水平随病毒增殖时间延长而逐渐提升，同时切割后的ATF6(C-ATF6)导致的ATF6通路激活也被检测出，说明感染PRV可导致BHK-21细胞的ER应激和后续UPR通路激活。同时，GRP94基因敲除细胞株在感染PRV后，GRP78表达量与BHK-21原始细胞感染PRV组别相比显著上调；而GRP94过表达的细胞在感染PRV后，GRP78的表达水平始终维持在较低水平。该结果表明，GRP78和GRP94在感染PRV后可能存在相互的功能代偿。

图6 不同BHK-21细胞感染PRV后UPR相关蛋白的表达Fig.6 Expression of UPR related protein in different BHK-21 cells infected with PRV

2.6 GRP94与PRV结构蛋白的互作

PRV病毒的结构蛋白Gb、gC、gD、gH、gI、gM、gN、gL在BHK-21细胞中瞬时表达，在anti-flag单克隆抗体的免疫沉淀复合物中检测GRP78和GRP94以判断分子伴侣蛋白与病毒结构蛋白是否存在互作。结果如图7和图8所示，gN仅与GRP78产生互作，gB、gD、gI与GRP78、GRP94均可以产生互作，gC、gH、gM、gL未与GRP78和GRP94产生互作。同时在anti-GRP78和anti-GRP94单克隆抗体的免疫沉淀反应中进行flag标签的检测验证，实验结果与上述结果一致。

图7 免疫共沉淀检测GRP94、GRP78与PRV病毒gB、gD、gN、gIFig.7 Immunoprecipitation tests of GRP78， GRP94 and gB， gD， gN， gI

图8 免疫共沉淀检测GRP94、GRP78与PRV病毒gC、gH、gL、gMFig.8 Immunoprecipitation tests of GRP78， GRP94 and gC， gH， gL， gM

以上结果表明，GRP78和GRP94均能与多种病毒膜糖蛋白相互作用，这种蛋白复合物滞留在内质网腔中，造成内质网肿胀并且进一步诱导内质网应激。GRP78所能结合的病毒蛋白相对于GRP94来说更加丰富，并且涵盖了GRP94所能结合的病毒蛋白。这或许提示了GRP78具有的功能与GRP94相似，且更加全面，GRP94缺失之后的功能代偿可能由GRP78来执行。

3 结论与讨论

内质网分子伴侣GRP78和GRP94定位于内质网和核膜中，当细胞内环境受到破坏，导致内质网应激时，GRPs基因表达，缓解内质网应激[12]。葡萄糖调节蛋白对于病毒增殖的影响已有初步证实，尤其是对GRP78而言，BHK-21中过表达GRP78基因后，坦布苏病毒(TMUV)的增殖得到加强，在GRP78受到抑制后，病毒增殖也相应减弱[13]。GRP94和GRP78的基因转录调控区有一个由28个碱基对组成的共同结构域，该结构域对GRP78和GRP94的高水平表达至关重要，且2个基因在转录水平上的调控机制非常相似[14]。在维护细胞稳态方面，GRP78和GRP94具有诸多相似的功能，可以和新翻译的蛋白质相结合，促进组装、折叠、运输[15-17]，可以和部分糖基化的病毒糖蛋白及其突变体形成复合物[17-19]，以及通过与钙离子的结合能力，调控内质网蛋白质的转运[20]。虽然他们两者之间具有相当密切的联系，但关于GRP94的研究较为匮乏，尤其是GRP94在病毒增殖调控方面。

本研究中，过表达GRP94细胞增殖PRV效价明显提高，表明GRP94可能参与病毒蛋白的折叠和组装。意外的是，GRP94敲除细胞株中PRV增殖滴度并未下降，基本保持不变。PRV病毒感染细胞株后的蛋白免疫印迹检测发现，GRP94敲除细胞株的GRP78表达量显著上升，上调的GRP78水平可能弥补了病毒增殖过程中GRP94的缺失。相对于GRP78，GRP94的基本功能需要在特定蛋白质的相互作用需要时才会表现出来[21]，通过CRISPR/Cas9系统敲除GRP94基因的细胞依旧能正常生长[22]，曾尝试敲除GRP78基因，但是挑选出的细胞克隆难以存活。这些证据都提示了GRP78相对于GRP94来说，蛋白功能更加丰富且对于宿主细胞而言是必需的。相关文献提出了类似的GRP78和GRP94在功能上相互协作，在抗体的表达折叠过程中GRP78和GRP94依次作用，发挥伴侣蛋白的功能[23-24]。在线虫中，也曾发现9个内质网伴侣蛋白之间存在相互代偿和相互调节的机制，其中便包括GRP78和GRP94[25]。

免疫共沉淀结果显示，GRP78和GRP94均可以和病毒蛋白互作。大量的蛋白复合物堆积在内质网腔内，造成内质网应激；与此同时，GRP94拥有促进蛋白质折叠的功能，与病毒蛋白结合后，加速病毒蛋白的折叠和组装，有利于病毒增殖。GRP94所能结合的病毒蛋白均能与GRP78相结合，进一步提示了GRP78与GRP94具有相似的蛋白功能，宿主细胞可能通过上调GRP78表达水平代偿因GRP94敲除而缺失的相关功能。