玉米ZmNLP5与ZmSTP1、ZmAAP2基因启动子区域相互作用的鉴定

袁崇渊，祝愿飞，陈 霞，朱 婵，王 毅，陶海燕，余娇娇

(玉溪师范学院 化学生物与环境学院， 云南 玉溪 653100)

碳(C)和氮(N)是植物生长发育过程中最重要的营养物质。在大多数植物中，C和N分别以糖和氨基酸的形式在韧皮部被运输到各“库”器官[1-2]。目前，对糖的长距离运输已进行了广泛的研究。糖转运蛋白位于多种植物的韧皮部。突变体实验表明，糖转运蛋白对韧皮部碳水化合物的运输起着关键性作用[3]。在拟南芥中，单糖转运蛋白由14个高度同源的STPs(糖转运蛋白)基因编码，通过质膜从质外体空间摄取己糖。目前，利用酵母异源表达已证实8个AtSTPs(1、 2、 3、 4、 6、 9、 11和13)能够催化己糖穿过质膜进入细胞[4]。STP1编码高亲和力糖转运蛋白STP1(H+/单糖共转运蛋白)，能够运输多种己糖[5-6]。STP1在植物间高度保守，介导己糖在不同组织细胞中运输，且表达具有组织特异性和发育时期特异性等特点[7-9]。AtSTP1在叶和茎等光合组织中表达水平最高，根、角果和花中则较低[10]。亚细胞定位结果显示，STP1位于细胞质膜上，参与单糖“源”到“库”的运输[7]，拟南芥中超表达STP家族成员能促进植物的生长和改善氮素的利用效率[11]。

植物中氮素的流通货币是氨基酸[12]，通过各种氨基酸转运蛋白在植物体内转移[13]。氨基酸渗透酶(amino acid permeases， AAPs)是一类研究较深入的氨基酸载体[12]。拟南芥的AAPs家族由8个成员组成(AtAAP1-8)，除AtAAP3和AtAAP5运输碱性氨基酸外，其他成员主要以中等亲和力的方式运输中性或酸性氨基酸[14-15]。GUS组织定位结果显示，AtAAP2在角果维管组织、成熟植物茎、叶和花梗中均表达[14，16-17]。进一步研究显示，AtAAP2的功能是将根中合成的氨基酸通过木质部-韧皮部的长距离运输方式转移到叶的主脉。敲除AtAAP2后，氮素向种子的转运以及种子蛋白质的含量均降低[1]。最新研究显示，拟南芥AAP2突变体中，叶片氨基酸分配增加，氮素分配方式的改变对碳同化和蔗糖由源到库的运输具有正向影响，从而提高了种子的产量和含油量[2]。小麦TaAAP2对子粒的蛋白含量以及产量同样起着决定性作用[18]。

目前，多个参与调控氮吸收和同化相关基因表达的重要氮响应转录因子已经被证实。例如，NLPs(NIN-like proteins)是一类植物特异性转录因子，在硝酸盐信号转导和同化过程中发挥重要作用[19-22]。NLPs有两个主要的保守结构域，一个是能与DNA结合的RWP-RK结构域，一个是参与高等植物蛋白与蛋白相互作用的PB1结构域[23-24]。非豆科植物NLPs蛋白的功能研究主要集中在模式生物拟南芥，遗传突变体和转基因植物研究表明：AtNLPs通过与硝酸盐响应顺式元件(NRE)结合，在调控早期的氮响应中发挥核心作用[19，25-26]。例如，AtNLP8是硝酸盐促进种子萌发的主调控因子，能直接与脱落酸(ABA)分解酶基因(CYP707A2)的启动子结合，并以硝酸盐依赖的方式降低ABA水平[27]。AtNLP7既能与NIR1基因启动子区域的NRE结合，使NIR1基因的表达量增加[19]，又能与关键的氮通路基因(ANR1、LBD37/38、NRT2和NIA1)结合，通过转录激活或抑制下游基因的表达来调节氮的同化和代谢[28-29]。最新研究显示，拟南芥根细胞中50%的AtNLP7瞬时和极瞬时靶基因，受AtNLP7的调控但并不与之结合，如已报道的LBD37/LBD38、CDF1、TGA4等，这些转录因子和HAP2C，以及一个Int-type DNA(At4g39780)作为AtNLP7的下游在根系中调控53%的氮响应基因[30]。AtNLP6的N-端含有一个硝酸盐依赖性的转录激活域且被证实在硝酸盐信号中扮演重要角色，同时推测其他的NLPs成员也有类似的功能[19]。研究发现，AtNLP6和AtNLP7能与另一个关键转录因子TCP20在连续硝酸盐供应和氮饥饿条件下相互作用，对控制硝酸盐响应基因和G2/M细胞周期标志性基因的表达起着重要作用[31]。此外，硝酸盐-CPK-NLP信号在植物中已被确定，硝酸盐触发Ca2+-CPK信号和硝酸盐偶联的CPK信号通路使NLP转录因子磷酸化，这一信号在植物营养生长网络中至关重要[32]。玉米是已知的对施氮表现出高产量的作物之一，其生长过程需大量氮肥的投入[33]。由于全球多数陆地土壤均存在缺氮现象，而作为陆地植物主要氮源的硝酸盐极容易流入水生生态系统，陆地植物需要适应其生长和代谢以响应氮素的波动[34-35]。硝酸盐是调节这一适应过程的关键信号分子，也是启动和调节植物氮素响应的重要生理信号[36]。由于硝酸盐诱导的基因表达不需要从头合成蛋白质[37]，硝酸盐很可能在翻译后激活某种存在但尚未识别的转录因子，进而激活硝酸盐响应机制[19]。玉米中参与硝酸盐信号转导和响应的转录因子在很大程度上是未知的。近年来，在玉米中鉴定出9个NLPs(ZmNLP1-ZmNLP9)成员，并对其基因结构进行了分析[21]。研究显示，施用硝态氮后ZmNLP4和ZmNLP5的表达水平显著上调[21]，且ZmNLP5是介导氮信号转导和代谢分子网络的中枢基因之一[22]。

本研究以前期转录组数据为研究基础，经基因功能注释后，ZmSTP1和ZmAAP2预测为碳氮转运蛋白，具有运输碳氮代谢产物的能力(数据未发表)，且基因启动子区域均含有一个NRE(图1)。研究旨在通过酵母单杂交系统，确定转录因子ZmNLP5能与ZmAAP2基因启动子的NRE结合，可能参与调控ZmAAP2基因的表达。研究结果不仅有助于进一步了解玉米硝酸盐信号转导的调控途径，也为今后其他植物硝酸盐信号转导的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株和质粒：酵母单杂交体系所用pAbAi载体、pGADT7-AD载体及酵母菌菌株均购自Clontech上海普迈生物科技有限公司。T-Vector pMDl9(Simple)载体购自TaKaRa宝日医生物技术有限公司，大肠杆菌DH5α感受态购自天根生化科技有限公司。

试剂药品：质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物公司；限制性内切酶、T4连接酶、PCR试剂均购自TaKaRa宝日医生物技术有限公司；LB液体和固体培养基、Amp抗生素以及引物购自上海生工生物工程有限公司；AbA抗生素、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1购自 Clontech上海普迈生物科技有限公司；YPDA/YPD培养基、SD/-Ura和SD/-Leu培养基均购自OXOID生物公司。

1.2 方法

1.2.1 pBait-AbAi构建

以前期已克隆到的ZmSTP1和ZmAAP2启动子序列的克隆质粒为模板，各选取一段包含NRE元件序列的诱饵扩增片段(约700 bp)设计引物(表1)。ZmSTP1和ZmAAP2的酶切位点分别为HindⅢ和XhoⅠ，KpnⅠ和XhoⅠ。克隆扩增程序为：95 °C 5 min，35个扩增循环(95 °C 15 s，52 °C 30 s，72 °C 40 s)，72 ℃延伸 10 min。使用1%的琼脂糖凝胶检测扩增片段，切胶回收后与pMD-19T室温(25 ℃)连接3 h，转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，涂布于LB+Amp固体培养基筛选阳性克隆，并测序鉴定。诱饵载体pAbAi和测序正确的T载分别用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ、KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物胶回收后连接pAbAi载体，转化大肠埃希菌DH5α，最后挑取阳性单克隆菌落测序鉴定。

图1 ZmSTP1和ZmAAP2基因启动子中NRE位点示意图Fig.1 Schematic diagram of nitrate response element of ZmSTP1 and ZmAAP2

1.2.2 感受态转化

为获得含诱饵表达载体的酵母菌株，需将构建好的诱饵表达载体转入Y1HGold菌株中。首先用限制性内切酶BstBⅠ酶切诱饵表达载体pAbAi-ZmSTP1、pAbAi- ZmAAP2、pMutant-AbAi(阴性对照)和p53-AbAi(阳性对照)，使其线性化。采用PEG/LiAC的方法转化酶母Y1Hgold，具体操作步骤按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2说明书进行。将转化后的菌液涂布于SD/-Ura固体培养基上，30 ℃培养箱中倒置培养3 d，挑取直径约2～3 mm单菌落，利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 进行菌落PCR，鉴定阳性菌落。

1.2.3 基因表达水平测定

为排除酵母内源转录因子与NRE顺式元件相互作用的干扰，在进行酵母单杂交实验之前需确定AbA抗生素最低使用浓度。从SD/-Ura固体培养基上挑取正常生长的单菌落，用0.9%的NaCl溶液重悬后，调整D600至0.002后分别涂布于含100、200、300和400 ng·mL-1AbA抗生素的SD/-Leu固体培养基上，30 ℃倒置培育3 d后观察菌落生长情况，确定单杂所需AbA抗生素的最低浓度。

1.2.4 pGADT7-AD构建

根据ZmNLP5转录因子的两个主要保守结构域RWP-RK和PB1的cDNA序列设计引物(表1)，分别命名为ZmNLP5-1和ZmNLP5-2，两个克隆片段的酶切位点均为NdeI和XhoI。克隆扩增程序为：95 °C预变性 5 min； 95 °C 15 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸30 s，35个扩增循环；72 ℃终延伸10 min。使用1%的琼脂糖凝胶检测扩增片段，切胶回收后与T载室温连接3 h，转化DH5α感受态细胞，涂布于LB+Amp固体培养基筛选阳性克隆，并测序鉴定。载体pGADT7-AD和测序正确的T载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物胶回收后连接pGADT7-AD载体，转化大肠埃希菌DH5α，挑取阳性单克隆菌落测序鉴定。

表1 克隆引物序列

1.2.5 酵母单杂鉴定

根据酵母转化系统Yeastmaker Yeast Transformation System 2中的转化方法，将质粒pGADT7-ZmNLP5-1/2分别转化诱饵菌株Y1H [pAbAi-ZmSTP1]和Y1H[pAbAi-ZmAAP2]感受态细胞。获得转化子Y1H[pAbAi-ZmSTP1/pGADT7-ZmNLP5-1/2]和Y1H[pAbAi-ZmAAP2/pGADT7-ZmNLP5-1/2]，其中Y1H[AbAi-P53/pGADT7]为阴性对照，Y1H[AbAi-P53/pGADT7-P53]为阳性对照。最后将转化子分别涂布于对照(SD/-Leu)和筛选(SD/-Leu/AbA)培养基，30 ℃倒置培养3～5 d后观察菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 诱饵载体pBait-AbAi线性化

由于游离的pBait-AbAi载体不能在酵母细胞中表达，需利用限制性内切酶BstBⅠ或BbsⅠ酶切使其线性化，线性化的pAbAi载体能与Y1HGold酵母基因Ura3-52位点进行同源重组，整合到酵母基因组，使其在酵母中稳定表达。此外，重组后的酵母细胞具有编码Ura的能力，可用于后续实验阳性诱饵酵母单菌落的筛选。诱饵质粒pAbAi-ZmAAP2和pAbAi-ZmSTP1经BstBⅠ单酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。

M, 10 000 plus DNA marker; 1，未经酶切的pAbAi-ZmAAP2质粒；2，单酶切后的pAbAi-ZmAAP2质粒；3，未经酶切的pAbAi-ZmSTP1质粒；4，单酶切后的pAbAi-ZmSTP1质粒。M, 10 000 plus DNA marker；1, pAbAi-ZmAAP2 plasmid without enzyme digestion; 2, pAbAi-ZmAAP2 plasmid after single enzyme digestion; 3, pAbAi-ZmSTP1 plasmid without enzyme digestion; 4, pAbAi-ZmSTP1 plasmid after single enzyme digestion.图2 诱饵载体线性化产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis image of the linearized products of bait

2.2 诱饵酵母AbAr背景表达水平检测

将线性化的诱饵质粒pAbAi-ZmSTP1和pAbAi-ZmAAP2分别转化Y1H酵母感受态细胞，阳性单克隆菌落经PCR验证后用0.9% 的NaCl溶液重悬，分别涂布于SD/-Leu和含AbA抗生素浓度梯度(100、200、300、400 ng·mL-1)的SD/-Leu培养基上。当AbA抗生素浓度为200 ng·mL-1时，酵母单菌落生长受到完全抑制，如图3所示，说明两个诱饵菌株Y1H(pAbAi-ZmSTP1)(图3-A)和Y1H(pAbAi-ZmAAP2)(图3-B)的最低AbA抗生素抑制浓度均为200 ng·mL-1。

A，诱饵菌株Y1H(pAbAi-ZmSTP1)；B，诱饵菌株Y1H(pAbAi-ZmAAP2)。A， Bait strain of Y1H(pAbAi-ZmSTP1)； B， Bait strain of Y1H(pAbAi-ZmAAP2).图3 诱饵酵母AbAr背景表达水平检测Fig.3 Detection of AbAr expression level in bait yeast strain

2.3 酵母单杂检测

将构建成功的猎物质粒转化诱饵菌株，分别涂布于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA抗生素培养基(AbA浓度为200 ng·mL-1)，30 ℃倒置培养3～5 d。如图4所示，阴性对照Y1H(AbAi-P53/pGADT7)菌株仅在SD/-Leu培养基中能正常生长，阳性对照Y1H9(AbAi-P53/pGADT7-P53)菌株在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA抗生素培养基中均能正常生长(图4-A， B)；猎物质粒pGADT7-ZmNLP5-1/2分别转化诱饵Y1H(pAbAi-ZmSTP1)感受态细胞后，在SD/-Leu平板上均有菌落生长(图4-C， D)，说明猎物蛋白成功转入宿主，SD/-Leu/AbA(200 ng·mL-1)平板无菌落生长(图4-C， D)，表明猎物蛋白没有激活诱饵报告基因的表达，ZmNLP5-1/2和ZmSTP1基因启动子区域无相互作用；猎物质粒pGADT7-ZmNLP5-1转化诱饵Y1H(pAbAi-ZmAAP2)感受态细胞，涂布于SD/-Leu和SD/-Leu/AbA(200 ng·mL-1)平板，两种固体培养基上均有菌落生长(图4-E)，说明pGADT7-ZmNLP5-1成功转入宿主并激活诱饵报告基因的表达，ZmNLP5-1和ZmAAP2基因启动子区域有相互作用；同理，pGADT7-ZmNLP5-2转化Y1H(pAbAi-ZmAAP2)菌株后，SD/-Leu培养基上有菌落生长(图4-F)，在含AbA抗生素浓度为200 ng·mL-1的SD/-Leu培养基无菌落生长(图4-F)，表明ZmNLP5-2和ZmAAP2基因启动子区域无相互作用。

A，阴性对照Y1H(AbAi-P53/pGADT7)；B，阳性对照Y1H(AbAi-P53/pGADT7-P53)；C，Y1H(pAbAi-ZmSTP1/pGADT7-ZmNLP5-1)相互作用图；D，Y1H(pAbAi-ZmSTP1/pGADT7-ZmNLP5-2)相互作用图；E，Y1H(pAbAi-ZmAAP2/pGADT7-ZmNLP5-1)相互作用图；F，Y1H(pAbAi-ZmAAP2/pGADT7-ZmNLP5-2)相互作用图。A， Negative control of Y1H(AbAi-P53/pGADT7)； B， Positive control of Y1H(AbAi-P53/pGADT7-P53)； C， The interaction of pGADT7-ZmNLP5-1and Y1H(pAbAi-ZmSTP1)； D， The interaction of pGADT7-ZmNLP5-2 and Y1H(pAbAi-ZmSTP1)； E， The interaction of pGADT7-ZmNLP5-1 and Y1H(pAbAi-ZmAAP2)； F， The interaction of pGADT7-ZmNLP5-2 and Y1H(pAbAi-ZmAAP2).图4 酵母单杂检测诱饵DNA和猎物蛋白的相互作用Fig.4 Interaction between bait DNA and prey protein was detected by yeast one-hybrid system

3 讨论

玉米是世界上重要的粮食和经济作物，因此，了解玉米如何对环境中氮水平的波动作出有效反应，是破译玉米氮素利用分子机制关键的一步。硝酸盐作为陆地植物的主要氮源以及诱导植物基因表达的信号分子[36]，参与调控多种基因的表达[19]，其中NRE存在于硝酸盐诱导表达的基因启动子区域参与植物对硝酸盐的响应[20]。对ZmSTP1和ZmAAP2基因的启动子序列分析发现，两者均含有一个大小为12 bp的NRE元件(图1)，研究显示，玉米和拟南芥基因中发现的氮相关调控基序，对植物在转录水平上硝酸盐的响应有协调作用[38]。植物特异性转录因子NLPs已被证实为硝酸盐调控基因[19-22]。蒺藜苜蓿中，MtNLP1能直接与结瘤基因MtCLE35的启动子结合并激活其表达[39]。大麦HvNLP2能与靶基因(HvNiR、HvNRT2.1和HvNR1)启动子中的NREs结合，直接激活靶基因的转录[40]。拟南芥AtNLP7可直接与AtNRT1.1启动子中的NRE结合，调节其表达；也可以与lncRNAT5120的启动子结合，调节硝酸盐的响应和同化[41-42]。此外，AtNLP7也能与AtTAR2基因启动子中的NRE结合并激活该基因的表达，从而促进硝酸盐依赖性的侧根的发育[43]。通过对RWP-RK和PB1保守结构域的同源性分析，玉米中已鉴定出9个ZmNLPs家族成员[21]。其中，ZmNLP3.1能识别ZmNRT2.1和ZmNRT2.2启动子区域的NREs，并激活靶基因的转录以响应硝酸盐[44]。Y1H实验表明，ZmNLP6和ZmNLP8能在体外直接结合ZmNRT1.2和ZmNiR2启动子区域的NREs[45]。ZmNLP5能结合ZmNIR1.1基因启动子区域的NRE，直接调控其表达[22]。本研究结果显示，ZmNLP5能与ZmAAP2基因启动子区域的NRE元件结合(图4)，但是否能直接调控ZmAAP2基因的表达以及参与玉米对硝酸盐的响应还待进一步研究。而ZmNLP5未通过NRE基序与ZmSTP1基因启动子结合(图4)，可能原因是：玉米中有9个NLPs成员，ZmSTP1可能与另一个ZmNLPs结合；或ZmNLP5通过与其他ZmNLPs成员相互作用来调控ZmSTP1基因的表达[22]；或ZmSTP1可能是ZmNLP5的瞬时或极瞬时靶基因，ZmNLP5短暂地与ZmSTP1基因启动子区域的NRE结合，由于物理不稳定性、可分析时间点和频率有限，酵母单杂交系统难以捕捉短暂或瞬时的转录因子-靶基因结合[30]。为排除酵母内源转录因子与NRE元件相互作用的干扰，本实验确定了重组诱饵质粒不能自激活Y1H Gold酵母报告基因的最低AbA抗生素浓度为200 ng·mL-1(图3)，小于最大阈值1 000 ng·mL-1，保证了实验结果的可靠性。

本研究通过酵母单杂交系统，确定了ZmNLP5-1和ZmAAP2基因启动子区域有相互作用；ZmNLP5-2和ZmAAP2、ZmNLP5-1/2和ZmSTP1基因启动子区域均无相互作用。ZmNLP5是能与ZmAAP2基因启动子NRE元件结合的转录因子。此外，本研究结果再次证实了NLPs的RWP-RK是一个能于DNA结合的结构域，PB1是一个蛋白和蛋白相互作用的结构域。