GPR30 激动剂对Aβ1-42 所致认知功能障碍的治疗作用及其机制研究

吕扬歌 吴凌智

嘉兴市第一医院（嘉兴学院附属医院）药学部，浙江嘉兴 314000

据统计，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者中，绝经期女性的发病率约为同年龄段男性的3 倍[1]，且其发病率与绝经后雌激素水平相关[2]。雌激素替代治疗可显著减少AD 患者大脑β 淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积，减轻神经元炎性反应和凋亡，对患者的认知功能也有显著改善作用[3,4]。然而，雌激素在治疗认知功能障碍的同时，也会增加乳腺、子宫、卵巢等肿瘤发病的风险[5,6]。雌激素的功能主要通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）介导，ER 有两种亚型：ERα 和ERβ，其中ERα 大量分布于子宫、卵巢等生殖器官，当与雌激素结合后，极易引发相关肿瘤[7,8]。2000 年，Filardo 等[9]发现一种新的G 蛋白耦联受体（G protein coupled receptor，GPR）可被17β 雌二醇结合，并发挥快速非基因组效应，该受体被命名为GPR30。GPR30 广泛表达于多种细胞，独立介导雌激素的非基因组效应的特点使其成为可避免雌激素治疗引起肿瘤风险、同时发挥认知功能改善作用的潜在靶点。cAMP 效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一种在神经细胞内广泛表达的调节基因转录的蛋白质，在神经元生长发育、神经突触形成及细胞修复等神经生理活动中起关键作用，其被激活后可调节下游基因如脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及凋亡相关基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3 等）的表达[10,11]。研究证实，雌激素可激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路并进一步激活CREB，而这一作用在无ER 的细胞系中也同样存在[12]，鉴于此，笔者推测GPR30 可通过上述信号通路影响AD 的病理过程，给予GPR30激动剂G1 可能通过与GPR30 受体结合，从而激活CREB/BDNF 通路影响神经元凋亡、再生功能，从而发挥抗AD 作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性SPF 级ICR 小鼠由南京青龙山动物饲养厂提供，体质量22～24g，小鼠可自由获取水和食物。将ICR 小鼠饲养到6 月龄后，按照体质量进行随机分组，分为对照组、模型组、阳性对照组、G1 低剂量组、G1 中剂量组、G1 高剂量组，每组各12 只。本研究经嘉兴学院医学院实验动物伦理委员会批准[伦理审批编号：JUMC2020-013；动物实验许可证编号：SYXK（浙）2020-007]。

1.2 主要试剂

Caspase-3、Bcl-2、Bax、CREB、p-CREB、BDNF抗体及山羊抗兔二抗购自美国Affinity Biosciences公司，G1 购自美国MedChemExpress 公司，Aβ1-42购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 动物模型的建立

将ICR 小鼠用水合氯醛（17.5mg/ml）麻醉后固定在立体定位仪上，坐标为距前囟2.0mm、距中线1.5mm、深度 2.0mm。将含有或不含有 Aβ1-42（410pmol/小鼠）的磷酸盐缓冲盐水（5μl）注射到双侧海马体中（每侧2.5μl，输注速度1μl/min），输注完毕后留针2min。

1.4 动物给药

造模结束48h 后，ICR 小鼠每日给予相应药物或溶剂（0.5%羟甲基纤维素钠），连续给药4 周。药物均使用0.5%羟甲基纤维素钠配制成混悬剂，现用现配。给药剂量：阳性对照组灌胃给予盐酸多奈哌齐1mg/kg；G1 低、中、高剂量组分别腹腔注射给予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg 的GPR30 激动剂G1；对照组和模型组给予等体积的溶剂。

1.5 行为学实验

1.5.1 Morris 水迷宫实验 整个实验分为三个阶段：①可见平台训练期为期2d：逃生平台固定放置于某处水面以下1cm，并在平台旁竖一面小旗标（高5cm）。小鼠每日进行4 次实验，每次实验间隔1h。当小鼠到达逃生平台时实验结束，记录小鼠到达逃生平台所需时间（逃避潜伏期）。若小鼠在90s 内未能找到平台则测试结束，并引导小鼠置于平台30s。②隐藏平台训练期为期3d：训练过程中，取下旗帜，其余同可见平台训练期。③第6 天为空间探索实验：撤去逃生平台，开始探索实验。小鼠从任一象限开始，面朝池壁放入水中，统计小鼠90s 内在平台目标象限停留时间百分比和穿越原平台位置次数。

1.5.2 避暗实验 Morris 水迷宫实验结束后间隔24h 进行避暗实验。实验分为2 天，第1 天为训练期，将小鼠腹朝拱门放入明箱，关闭箱底交流电让小鼠适应环境2min，然后打开暗箱底部交流电，重新将小鼠腹朝拱门放入明箱，记录5min 内小鼠的逃避潜伏期和错误次数，作为训练成绩；第2 天为测试期，再次将小鼠腹朝拱门放入明箱，记录5min 内小鼠的逃避潜伏期和错误次数，作为测试成绩。若5min 内小鼠未进入暗箱，则逃避潜伏期记为300s，错误次数记为0 次。

1.5.3 新物体识别实验 实验过程分为适应期、熟悉期和测试期。在第1 天适应期时，每组小鼠均依次放入旷场箱中适应5min。第2 天熟悉期则需将两个相同的物体分别放入旷场箱的左右两侧，每组小鼠于箱中适应5min。第3 天为测试期，将第2 天放入旷场箱中2 个相同物体的其中一个更换为新物体后，将小鼠放入旷场箱中进行测试。统计小鼠对熟悉物体A 及新物体B 的探索时间EA、EB，计算小鼠的识别指数（discrimination index，DI），DI=（EB-EA）/（EA+EB）。

1.6 蛋白质印迹法检测

小鼠脱颈处死后迅速提取海马组织样本，提取蛋白，采用蛋白质印迹法检测小鼠海马组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、BDNF、CREB、p-CREB 的表达水平，分析GPR30 对神经元凋亡和再生的调节作用及机制。

1.7 统计学方法

使用SPSS 20.0 软件对数据进行处理和分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPR30 激动剂可改善Aβ1-42小鼠认知功能障碍

Morris 水迷宫实验中，小鼠在可见平台测试第1天中表现出相似的逃避潜伏期，表明给予Aβ1-42或G1对小鼠的视力或基础动力无显著影响（P＞0.05），见图1A。隐藏平台训练期数据显示，各组小鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短，训练期第5 天，模型组小鼠的逃避潜伏期显著长于对照组（P＜0.001），G1 中、高剂量组小鼠的逃避潜伏期均显著短于模型组（P＜0.05），见图1A。在空间探索实验中，与对照组相比，模型组小鼠的目标象限停留时间百分比和穿越平台次数显著降低（P＜0.05）；G1 高剂量组小鼠上述两个指标均显著高于模型组（P＜0.05），见图1B、图1C。

避暗实验中，对照组小鼠的错误次数显著少于模型组（P＜0.001），避暗潜伏期显著长于模型组（P＜0.01）；G1 中、高剂量组小鼠的错误次数均显著少于模型组（P＜0.05），避暗潜伏期均显著长于模型组（P＜0.05），见图1D、图1E。

新物体识别实验中，模型组小鼠的DI 显著低于对照组（P＜0.01）；G1 中、高剂量组小鼠的DI 均显著高于模型组（P＜0.05），见图1F。

图1 GPR30 激动剂对Aβ1-42诱导的小鼠认知功能障碍的作用

2.2 GPR30 激动剂抑制Aβ1-42小鼠海马组织凋亡相关蛋白的表达

与对照组比较，模型组小鼠海马组织中的Bcl-2/Bax 比例降低，活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例升高（P＜0.001）；G1 高剂量组小鼠海马组织中的Bcl-2/Bax 比例显著高于模型组（P＜0.05），G1 中、高剂量组小鼠活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例均显著低于模型组（P＜0.05），见图2。

图2 GPR30 激动剂对小鼠海马组织中caspase-3、Bax 和Bcl-2 表达水平的影响

2.3 GPR30 激动剂增加 Aβ1-42 小鼠海马组织中p-CREB/CREB 和mBDNF/proBDNF 的比例

与对照组比较，模型组小鼠海马组织中的p-CREB/CREB 水平显著低于对照组（P＜0.01）；G1 高剂量组小鼠海马组织中的p-CREB/CREB 水平显著高于模型组（P＜0.05）。模型组小鼠海马组织中的 mBDNF/proBDNF 的比例显著低于对照组（P＜0.001），G1 高剂量组小鼠海马组织中的mBDNF/proBDNF 的比例显著高于模型组（P＜0.05），见图3。

图3 GPR30 激动剂对小鼠海马组织中CREB 和BDNF 表达水平的影响

3 讨论

AD 的病因复杂多样，目前还未能得出统一结论，但AD 患者的神经病理学改变几乎完全一致，主要表现为脑内出现老年斑和神经原纤维缠结，大脑皮层和海马回神经元丢失及突触数量减少等[13-15]。在这些病理改变的基础上提出一系列AD 发病机制的假说，包括Aβ 级联假说、慢性炎症假说、Tau 蛋白假说等[14,16]。其中Aβ 级联假说被认为是AD 发病最关键的因素，受到广泛认可[17]。Aβ 是Master 等[18]在1985 年首次从老年斑中分离出的核心成分，在正常生理条件下，Aβ 的生成和代谢处于动态平衡，但当多种因素引起Aβ 代谢平衡紊乱时，Aβ 可在大脑皮层和海马区域出现异常增多和沉积，引发突触变化、神经元损伤、炎性反应、神经递质丢失等，最终导致大脑功能失调，产生认知功能障碍[19]。目前已证实的AD 相关高发基因的变异均与Aβ 的异常增多和沉积有关[16]。

本研究采用Aβ1-42脑室注射诱导产生小鼠AD 模型，通过行为学实验和相关蛋白检测研究GPR30 对AD 所致的认知功能障碍和神经元损伤的作用。在水迷宫实验等行为学实验中，模型组小鼠的认知能力较对照组小鼠显著降低，给予G1 后可显著逆转Aβ1-42的这一作用，提示GPR30 激动剂G1 可显著改善Aβ1-42所致的小鼠认知功能障碍。

神经元凋亡是AD 引起认知功能障碍的最主要原因，研究表明Aβ1-42在脑部的聚集会产生多种神经毒性效应，如神经炎症、神经元凋亡、兴奋性毒性、钙稳态破坏、Tau 蛋白高度磷酸化等，导致AD 患者的神经元大量丢失，最终导致患者的认知功能进行性下降。在AD 发生早期，即可在AD 患者大脑中观察到Aβ 的沉积及其引起的氧化应激、炎症和神经细胞凋亡[20]。在此过程中，caspase-3、Bcl-2、Bax 扮演着重要的调控角色，为初步探究GPR30 激动剂对Aβ1-42所致小鼠认知功能障碍改善的潜在机制，对小鼠海马和皮层组织中的凋亡及神经营养相关蛋白表达水平进行检测，结果显示，Aβ1-42可引起p-CREB/CREB、mBDNF/proBDNF、Bcl-2/Bax 降低，激活caspase-3，导致小鼠神经元凋亡。而GPR30 激动剂G1 可显著逆转由Aβ1-42引起的这一系列凋亡和神经营养相关蛋白的变化。

综上所述，给予GPR30 激动剂可显著改善AD模型鼠的认知功能，逆转Aβ1-42所致神经元凋亡，促进神经元再生，这一作用的分子机制可能是通过激活CREB/BDNF 通路，进而调节Bcl-2、Bax、caspase-3和BDNF 的表达水平，从而发挥抗AD 作用。这些发现为GPR30 在Aβ1-42诱导的认知障碍和细胞凋亡中的作用提供了新的见解。同时也为我们进一步研究GPR30 改善AD 所致的认知功能障碍的分子机制提供了重要的实验基础和参考依据。