血清同型半胱氨酸水平与单核细胞亚型及颈动脉动脉粥样硬化斑块稳定性的相关性

吴 燕 姜烜星 王雪梅 王 丽

1.河西学院附属张掖人民医院健康管理中心，甘肃张掖 734000；2.河西学院附属张掖人民医院检验中心，甘肃张掖 734000

高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）是动脉粥样硬化及血栓形成的风险因素[1,2]。研究发现，约40%的心脑血管疾病患者合并HHcy，而健康群体中仅有15%合并HHcy[3]。研究显示同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）可能参与动脉粥样硬化斑块生成及脱落为血栓的过程，但其致斑块稳定性变化的机制目前尚不明确[4]。Hcy 可诱导单核细胞向炎症型分化，并产生促炎作用，而炎症型单核细胞是动脉粥样硬化进展的关键细胞[1]。因此，HHcy可能与单核细胞亚群的比例有相关性，且参与调节动脉粥样硬化患者的斑块稳定性。本研究拟探讨血清Hcy 水平与单核细胞等动脉粥样硬化危险因素之间的相关性，并分析Hcy 与单核细胞亚型、斑块稳定性之间的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2020 年11 月至2022 年2 月于河西学院附属张掖人民医院健康管理中心体检的246 例体检者进行回顾性队列研究，纳入对象年龄40～70 岁，根据超声检查有无颈动脉斑块及斑块性质，将其分为健康对照组（无颈动脉斑块，40 例）、稳定斑块组（101例）和不稳定斑块组（105 例）。颈动脉斑块的诊断参照《中国脑卒中血管超声检查指导规范》[5]：内-中膜厚度（intimal medial thickness，IMT）≥1.5mm，凸出于血管腔内，或局限性内膜增厚高于周边IMT的50%时，定义为动脉粥样硬化斑块形成。其中扁平斑、硬斑为稳定斑块，软斑、溃疡斑为不稳定斑块，同时存在稳定斑块和不稳定斑块者归为不稳定斑块。排除既往有明确冠心病、糖尿病病史者；曾行冠状动脉支架植入术或旁路移植术者；合并各种急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、造血功能障碍、H 型高血压、肝肾功能障碍者；使用降血脂药物、糖皮质激素等其他影响免疫系统或造血功能的药物者。

1.2 观察指标

主要观察指标包括血脂指标、Hcy、单核细胞比例。为进一步统计分析，将以下变量定义为分类变量：Hcy≥15.0μmol/L 为高Hcy，Hcy＜15μmol/L 为正常Hcy，单核细胞比例＞8%为单核细胞升高，3%～8%为正常水平。血常规检查由希森美康医用电子（上海）有限公司生产的XN9000 全自动血细胞分析仪测定。生化项目由西门子医学诊断产品（上海）有限公司生产的ADV IA2400 全自动生化分析仪测定。

1.3 外周血单个核细胞的提取和储存

患者超声检查当天，收集血液提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。全血3000 转/min 离心15min 去除血浆，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）1 ∶1 稀释，并在Ficoll-Paque 上、25℃下2000 转/min 离心20min。从中间相中提取PBMC，PBS 洗涤3 次，每次10min。将PBMC 手动重悬于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640 培养基中并储存于–80℃。

1.4 流式细胞术分析

另招募30 例颈动脉斑块患者（稳定斑块15 例、不稳定斑块15 例）采用流式细胞术检测单核细胞分型，并分析其与血清Hcy 水平的关系。根据国际免疫学会对单核细胞的分类，基于单核细胞表面CD14和 CD16 的表达强度，将单核细胞分为炎症型（CD14++CD16-）和定居型（CD14+CD16+）。流式分析数据采用Flowjo 10.4 软件进行处理。

1.5 统计学方法

应用Graphpad Prism 8.0 统计软件进行数据分析和图像绘制。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用独立样本t检验和方差分析，不服从正态分布的则以中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示，比较采用Kruskal-Wallis 检验。采用Spearman 和Pearson 相关性分析法分析Hcy 与血脂指标的相关性；计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组研究对象的临床特征比较

三组研究对象的年龄、性别、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、载脂蛋白B 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；吸烟＞5 年、Hcy≥15μmol/L比例、Hcy、单核细胞比例、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、载脂蛋白A 比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组研究对象的临床特征比较

2.2 血清Hcy 与血脂及单核细胞比例的相关性分析

相关性分析结果显示，血清Hcy 水平与单核细胞比例、TC、TG、LDL、载脂蛋白A、载脂蛋白B水平均呈较弱的正相关（P＜0.05），而与HDL 水平呈弱的负相关（P＜0.05），见表2。

表2 血清Hcy 水平与血脂及单核细胞比例的相关性分析

2.3 单核细胞亚型对颈动脉斑块性质的影响

不稳定斑块组的单核细胞总数量、炎症型单核细胞数量、血清Hcy 水平均显著高于稳定斑块组（P＜0.05），见表3。相关性分析结果显示，炎症型单核细胞与血清Hcy 水平呈弱的正相关（r2=0.664，P＜0.001），见图1。

表3 不同颈动脉斑块性质的单核细胞亚型数量及Hcy 水平比较（）

表3 不同颈动脉斑块性质的单核细胞亚型数量及Hcy 水平比较（）

图1 炎症型单核细胞与Hcy 水平的相关性

3 讨论

颈动脉粥样硬化斑块是脑血管血栓栓塞的主要来源，不稳定斑块的形成与炎症密切相关。不稳定斑块的形成可增加脑梗死的发病风险。脑梗死致残率高，严重危害人类健康，并增加社会和家庭的经济负担[6]。研究发现，HHcy 增加血管炎性反应及斑块面积，血清Hcy 水平每升高5μmol/L，则心血管疾病风险增加1.6～1.8 倍[7]。本研究显示，不稳定斑块组患者的血清Hcy 水平高于稳定斑块组和健康对照组，稳定斑块组患者的血清Hcy 水平高于健康对照组，这与石程程等[6]研究结果一致。

近年来，大量研究证实动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程[8-12]。为此，笔者分析了不同组间Hcy 水平与血脂指标之间的关系，进一步为Hcy 水平升高与斑块稳定性密切相关提供解释。本研究相关性分析发现血清Hcy 水平与TC、TG、LDL、载脂蛋白A、载脂蛋白B 水平具有较弱的正相关，与HDL 水平具有弱的负相关。这一现象可通过Ravnskov 等[13]的假说来解释。该假说认为，不稳定斑块起源于与微生物复合的脂蛋白聚集体造成的血管阻塞，而这一过程因Hcy 硫代内酯聚集脂蛋白而加剧发展。HHcy 导致血管内皮功能障碍、血管阻塞，造成动脉壁缺血、壁内细胞死亡、毛细血管破裂，继而动脉内膜内微生物释放，引起出血、炎症，最终导致不稳定斑块形成。

单核细胞是免疫效应细胞，是动脉粥样硬化形成过程中最常见的炎症细胞，是斑块重要组成部分，同时也是易损斑块形成的重要病理生理学基础。在动脉粥样硬化斑块形成的过程中，外周血单核细胞迁移至动脉内膜下，分化为巨噬细胞，摄取氧化的LDL，从而构成动脉粥样硬化病变的核心并导致不稳定斑块的形成[14]。近年来，研究显示炎症型单核细胞在动脉硬化粥样斑块形成与破裂过程中至关重要；相反，定居型单核细胞在病变早期可通过抑制局部炎症及延缓斑块进展、在斑块破裂后通过抑制血栓形成及促进新生血管生成等途径改善局部心肌灌注。有研究认为白细胞及其亚型数目与梗死灶周围炎性反应、强度和斑块稳定性相关[6,15-17]。然而，有关斑块稳定性和单核细胞分型及亚型的比例之间是否具有一定关系却很少被人研究，现有研究主要集中在单核细胞与早期疾病阶段之间的关联，例如颈动脉内膜中层厚度[18]。本研究通过回顾性分析246例体检者的病历资料，研究血清Hcy 水平与颈动脉粥样硬化斑块稳定性及其独立风险因素之间的关系；通过募集的30 例颈动脉斑块患者的血液样本，分析单核细胞亚型、斑块稳定性、血清Hcy 水平之间的联系。相比于稳定型斑块患者，不稳定斑块患者的总CD14+单核细胞和炎症型单核细胞增加，而定居型单核细胞未见明显变化；提示Hcy 可能促进循环单核细胞向炎症型分化，进而通过局部产生炎症因子和蛋白酶来促进不稳定斑块的形成。本研究以观察性研究为主，暂尚无直接证据来确定因果关系，还需今后通过动物模型及大样本量研究进一步验证。