羊布氏杆菌病快速检测技术应用比较

2022-11-28

畜禽业 2022年1期

(江苏省常熟市梅李动物防疫站，江苏常熟 215511)

0 引言

羊布氏杆菌属于一种慢性传染病，对生殖系统的危害性较高，以公羊产生睾丸炎与母羊出现流产等现象为主要特征。该病的临床表现相对隐蔽，传染性较高，检测难度较大。传统的诊断方法耗时较长、操作繁琐，需要借助多种精密仪器才能得出判定结果，难以有效在基层中推广。为了解决此类问题，本文将对几种快速检测技术的实验过程进行深入讨论，从而找出最适合在基层应用的检测方法。

1 实验过程

1.1 材料准备

所需准备的实验材料主要包括：被检试样，以江苏省常熟市某地区随机收集的160份绵羊血液作为分析对象；菌株与DNA，从畜牧公司采购M5株、从检验检疫局获得大肠杆菌与沙门氏菌的DNA；引物，布氏杆菌与PCR的引物均需根据国标T1088的相关规定完成，本文所采用的引物是由某科技公司合成而得；主要试剂，缓冲液、聚合酶、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、分子标记、核酸燃料、荧光目视检测试剂盒与血液基因提取试剂盒；主要仪器，电泳仪、冰箱、离心机、浊度仪、PCR仪、微量振荡器与移液器；羊血液基因组，需要根据提取试剂盒的操作规范来完成提取操作；M5株与DNA的提取，需要依照国标T2714所规定的方法完成。

1.2 检测方法

1.2.1 金属浴LAMP扩增

该方法使用的材料剂量为：反应缓冲液12.5 μL、引物30 μL、聚合酶1.0 μL、去离子水6.0 μL、模板1.5 μL。而反应条件为：金属干浴锅63℃ 50 min，90℃ 10 min。实验流程为：在反应管内的混合物调试均匀后放置在金属浴锅中完成LAMP的扩增，待反应结束后观测管内是否存有白色混浊物，之后将离心机设定为6 000 rpm 5 min，观察是否存在白色沉淀。同时实验过程所采用的模板应为M5株DNA、双蒸水，二者分别对应阳性对照与阴性对照，此外还要提前准备好待测样品DNA。

1.2.2 浊度仪LAMP扩增

该方法所使用的材料剂量为：反应缓冲液12.0 μL、引物2.5 μL、聚合酶1.0 μL、去离子水6.0 μL、模板1.5 μL。反应条件为：浊度仪的设置应为80℃ 10 min、63℃ 40 min。实验流程为：反应管内的混合物在调试均匀后放置在浊度仪中完成LAMP的扩增。待反应结束后，可观测柱状下层的颜色呈现状况，其中红色代表阳性，绿色则表示为阴性。而实验过程中采用的模板则分别为：大肠杆菌DNA、绿脓杆菌DNA、沙门氏菌DNA，三者作为阴性对照。M5株DNA则作为阳性对照。此外还要准备双蒸水以及待测样品DNA。

1.2.3 荧光目视检测试剂盒法

该方法所使用的材料剂量分别为：反应缓冲液12.0 μL、引物3.5 μL、聚合酶1.0 μL、去离子水5.0 μL、模板1.5 μL、黄绿素染料1.0 μL。反应条件为：金属干浴锅需设定为63℃ 50 min、90℃ 10 min。实验流程为：反应管内的混合物在调试均匀后放置在金属干浴锅中完成LAMP扩增，待反应结束后，可观察反应管呈现的具体颜色，并通过紫外线照射来判断是否有荧光产生。在实验过程中所使用的模板为M5株DNA与双蒸水，二者分别作为阳性对照与阴性对照，同时还要准备好待测样品DNA。

1.2.4 PCR扩增

该方法所使用的材料剂量分别为：反应缓冲液13.0 μL、引物1.0 μL、聚合酶0.5 μL、脱氧核糖核苷三磷酸2.0 μL、氯化镁3.0 μL、去离子水13.0 μL、模板1.5 μL、黄绿素燃料1.0 μL。反应条件为：95℃ 15 s、95℃ 5 min、52℃ 30 s、70℃ 90 s，72℃ 5 min，完成40个循环。实验流程为：反应管内的混合物在调试均匀后放置在PCR仪上，待反应结束后，提取5 μL的产物，进行2.0%的琼脂糖电泳后，放置在凝胶成像仪中完成观察记录。在实验过程中所使用的模板为M5株DNA与双蒸水，二者分别作为阳性对照与阴性对照，同时还要准备好待测样品DNA。

2 实验结果

2.1 金属浴LAMP扩增结果

经过63℃ 50 min、90℃ 10 min的LAMP扩增后，在阳性对照管以及待测试样管中可发现白色混浊物，在完成6 000 rpm 5 min的离心处理后会出现沉淀现象，此类现象说明布氏杆菌在扩增时会伴有大量的硫酸镁生产，并在离心后沉淀效果愈发明显。而阴性对照管则未发现明显变化，证明布氏杆菌未出现扩增。使用该检测方法测试的160份羊血液中，共有12份检测出布氏杆菌[1]。

2.2 浊度仪LAMP扩增结果

在经过63℃ 40 min、80℃ 10 min的浊度仪扩增后，可在2号检测通道观察到蓝色柱状图，并且底部呈现红色，证明该通道为阳性反应，有布氏杆菌扩增生成。而其余的通道未产生蓝色柱状图并且底部多为绿色，证明阴性对照管没有完成布氏杆菌的扩增。待测试样管所对应的3号通道有明显的蓝色柱状图产生，并且底部同样呈现为红色，证明该试管发生了布氏杆菌的扩增。使用该检测方法测试的160份羊血液中，共有12份检测出布氏杆菌。

2.3 荧光目视检测试剂盒法扩增结果

在金属干浴锅经过90℃ 10 min、63℃ 50 min的扩增后，可在阳性反应管中看到红色转换为绿色的颜色变化，证明该试管中出现布氏杆菌阳性扩增，而阴性反应管的颜色未出现明显改变，始终为橙红色，证明未出现布氏杆菌的扩增。而待测样品反应管与阳性反应管的颜色变化趋势一致，都是由红色转变为绿色，证明出现了布氏杆菌的扩增。之后利用紫外线照射进行实际结果的观测，可发现扩增出的布氏杆菌反应管在照射下产生荧光，而没有扩增出布氏杆菌的反应管则没有荧光产出。使用该检测方法测试的160份羊血液中，共有12份检测出布氏杆菌[2]。

2.4 PCR扩增结果

根据电泳结果可知，M5株阳性DNA以及待测试样在800 bp与180 bp存在条带，证明有布氏杆菌扩增而出，而阴性试样与5号泳道的待测试样只在800 bp存在条带，证明未出现布氏杆菌扩增状况。该检测结果与T1011的判定方法相符。该检测方法同样以160份羊血液作为实验对象，发现的布氏杆菌共计10份。

3 实验分析

布氏杆菌对各国畜牧业都产生了恶劣的影响，不仅使羊群的生殖器官、内脏受到破坏，还造成了大量经济损失，同时也对畜牧人员的生命安全产生威胁。随着分子生物学的进一步成熟与发展，PCR、LAMP等基因检测方法的应用越来越受到人们重视，新的基因检测方法也在不断开发、研究当中。

以往的检测流程过于繁琐与复杂，并且对实验仪器的要求相对严格，这就导致传统的检测方法已无法满足基层测试的相关需要。但LAMP技术却能有效解决此类问题，由于其使用的引物是对DNA链上的区段进行针对性设计的，相较于传统的PCR探针只能对2个区段设计引物，更好地实现了特异性的优化，在进行反应时所采用的置换型合成酶也能够在60℃～65℃的环境下完成DNA扩增，使检测的时间被大幅缩短。同时LAMP技术对实验仪器的要求较低，具有良好的适用性与经济性，以上优点足以证明LAMP反应更适合用在基层检测中。此外，在DNA合成过程中，需要从DNTPS中提取焦磷酸离子以及镁离子，确保二者在反应溶液中充分反应，并生成白色沉淀焦磷酸镁。本次实验即是采用此反应原理使LAMP方法能够在金属浴中被良好应用，根据实验结果显示阳性反应管内会产生白色浑浊，并且反应现象十分明显，达到肉眼可见的级别。这足以证明LAMP方法可以实现布氏杆菌的扩增，实验原理与实际结果保持一致。同时该方法的操作流程简易，对设备的要求较低，对人员的技术要求偏低。而且LAMP反应从始至终都无需完成反应管的开启，这不仅可以防止气溶胶的形成，避免DNA污染导致假阳性的产生，还完全符合基层的快速检测条件[3]。

为了保证实验结果具有较高的可信度与可靠性，本次实验也采用了LAMP浊度仪进行布氏杆菌的检测，该方法可以对生成的焦磷酸镁沉淀的浑浊度进行检测，之后以数据图的形式呈现基因是否产生扩增现象。在反应完成后，便可直接观察通道的改变状况，如果有蓝色柱状产生并且底部出现红色则证明目的基因被有效扩增出，代表阳性，反之则代表阴性。根据实验结果显示，LAMP浊度仪的观测效果良好，可以直接反映基因的具体扩增量以及变化情况，但由于设备本身的造价较为高昂，因此在基层应用中难以得到有效推广。

LAMP反应过程中出现的扩增物在与黄绿素染料充分结合的情况下，能够产生相应的颜色变化，依照此原理，实验中可通过荧光目视检测试剂盒进行布氏杆菌的检测。实验结果显示，在加入检测试剂后，反应溶液会变为绿色代表阳性，若反应溶液无颜色变化则为阴性，而在紫外光照射下出现荧光为阳性，未产生荧光则为阴性。这种可视度较高的变化能够使判定结果更加准确、清晰，但有数据显示该反应的时间较长，通常要高于1 h，容易产生假阳性，并且试剂盒的成本较高，还需应用紫外照射设备，因此同样不适用于基层检测。

综上所述，本次实验所采取的3种LAMP快速检测方法的检出效果均好于以往的PCR检测方法，而且3种方法的阳性检出率一致，重复率相同。这其中金属浴LAMP的应用效果佳，并且该方法无论是在试剂方面还是在实验设备方面都不需要投入过高的成本费用，同时也能保证极高的检出率和良好的检测效果，因此相比较于其他两种LAMP快速检测法更适合在基层中进行应用，能够切实满足相关使用条件，值得推广。