miRNA在视网膜母细胞瘤中的作用研究进展△

吴 沙 邹梦怡 廖洪斐

视网膜母细胞瘤(RB)是儿童最常见的原发性眼眶内恶性肿瘤，约占所有儿童癌症的3%。尽管RB很少见，但在癌症管理的许多方面，包括分类方案、治疗方式、基因检测和筛查，一直是肿瘤学领域的基石。在发达国家中，RB患儿存活率超过95%，但在发展中国家这个概率却低得多。一项来自全球RB就诊报告和国民收入水平分析结果显示：国民收入越低，就诊年龄越大，确诊肿瘤晚期和远处转移的比例越高[1]。目前已发现大量microRNAs(miRNA)在人类癌症中表达上调或下调[2]，并通过与靶基因序列互补，调控蛋白质编码基因而发挥致癌或抑癌功能。miRNA是一类非编码小RNA，可以通过细胞和分子途径的靶向序列参与多种生物过程。miRNA在RB的病理过程、诊断及治疗中具有重要的作用。本文现对此研究进展作一综述。

1 RB

RB是一种起源于视网膜光感受器的恶性肿瘤，是婴幼儿最常见的原发性眼内恶性肿瘤，临床表现以白瞳症和斜视为主，发病无种族、地域和性别差异。RB分为遗传型和非遗传型两种类型。遗传型大约占40%，在遗传型RB中，所有细胞都发生了一个RB1等位基因的突变。当再次发生突变事件影响第二个等位基因时，细胞可能会发生恶性转移[4]，这类患儿大多数为双侧和多灶性发病。非遗传型RB是单侧的，无遗传倾向，不易合并第二种肿瘤。RB的治疗是高度个性化的，需要多学科团队根据肿瘤的临床和影像学特征来制定治疗方案[5]。在大多数情况下，化学治疗是主要的治疗方法，可与局部治疗结合使用。化学治疗失败或者晚期病例，通常需行眼球摘除术[6]。

2 miRNA

miRNA是一种单链RNA，长度约22 nt，具有物种间高度保守性、表达时序性以及组织特异性，在调节细胞生长和发育过程中起多种作用。由较长的初级转录产物在经过多步核酸酶的剪切、加工后产生的，随后被组装入RNA诱导的沉默复合体，通过碱基的互补配对方式识别靶mRNA，并依据互补的不同程度指导沉默复合体进行降解目标mRNA或者阻遏目标mRNA的翻译。从1993年发现首个miRNA，到现在新一代基因测序和其他方法普遍应用，在短短的二十多年里，miRNA在生物学的研究领域得到了极大的发展[7]。miRNA不仅可以作为诊断的生物学指标，而且可以作为新的治疗靶点。

3 miRNA在RB的研究进展

3.1 miRNA在RB的病理机制RB主要是由视网膜细胞中RB1基因的失活引发的。但是，除RB1突变外，其他遗传改变特别是异常表达的miRNA在RB的肿瘤发生和发展中起关键作用[8]。Tian等[9]通过对人和小鼠RB相关miRNA-mRNA调控网络和途径的鉴定，发现7条miRNAs(hsa-miR-373、hsa-miR-34a、hsamiR-129、hsa-miR-494、hsa-miR-503、hsa-let-7和hsamiR-518c)与RB相关。这些miRNA通过调节包括CCND1、CDC25C、E2F2和CDKN2D在内的靶标，以及“细胞周期”和“癌症途径”在RB发生中起关键作用。Xu等[10]研究表明，miR-494可能作为肿瘤启动子起作用，并通过靶向PTEN调节RB进展。Li等[11]研究表明，miR-433通过抑制Notch1和PAX6的表达来调节RB细胞的增殖和转移。Bu等[12]研究发现，miR-106b作为致癌基因，通过抑制ZBTB4蛋白的表达来促进WERI-Rb-1细胞的增殖、迁移和侵袭，并且与疾病的严重性密切相关。综上所述，miRNA在RB的发生和发展过程发挥重要作用。

3.2 miRNA在RB诊断方面的应用RB是最严重的眼内肿瘤，通常难以诊断，而且儿科人群中遇到的眼眶异常也与成人患者中发现的眼眶异常大不相同[13]。目前CT和MRI已经广泛扩展了眼眶成像的能力，并为许多其他肿瘤的诊断提供了有用的信息。考虑到较高的辐射剂量，以及患儿年龄小难以配合，CT和MRI对于RB的早期诊断有一定的缺陷。RB是首批具有已知遗传病因的肿瘤之一，突变传递给下一代的概率约为40%。高危家庭成员均应早期筛查，对患者的肿瘤组织和血液样本及患者家属的血液样本进行遗传学研究至关重要。早期诊断关系到患儿保留视力，拯救眼睛和生命的机会。Beta等[14]通过比较RB患儿和正常儿童血清中差异表达的miRNA，发现miR-17、miR-18a和miR-20a在血清样本中显著表达，探索了血清中miRNA作为非侵入性诊断的潜力。Liu等[15]收集65例RB患者和65例健康个体血浆样本作为对照，发现microRNA-320、microRNA-let-7e和microRNA-21可以作为检测RB的新型潜在生物标志物。Zheng等[16]测量RB组织和邻近正常组织中miR-144表达水平，以及来自RB患者和健康对照者的血清样品，发现RB患者肿瘤组织中miR-144表达水平显著降低，miR-144表达水平与RB患者的肿瘤大小和转移呈正相关，提示其可作为RB诊断和预后的标志物。Zhou等[17]研究发现，血清中miR-338-5p有可能成为RB的肿瘤标志物，并且与神经元特异性烯醇化酶(NSE)联合使用可以提高RB的早期诊断率。因此，miRNA在RB的诊断中具有重要的价值，可能成为新的诊断学生物标志物。

3.3 miRNA在RB治疗方面的应用RB的治疗在过去的几十年中逐渐发展，其目的不仅是保护生命和眼睛，而且优化残余视力。RB的治疗是多模式的，化学治疗、经瞳孔温热疗法、冷冻和激光光凝等局部治疗、放射治疗和手术治疗都起着至关重要的作用[18]。尽管最近的治疗进展使RB成为可治愈的肿瘤，但由于化学抗性的复杂机制和化学疗法的毒性[19]，以及发生继发性肿瘤的风险，长期存活的可能性很低[20]，迫切需要新的治疗方法。近年来，大量研究发现RB相关miRNA的表达、作用和相关机制可能有助于为RB患者开发新的治疗策略[21]。

3.3.1 miRNA上调在RB靶向治疗方面的应用Wang等[22]对microRNA-143在正常人视网膜组织样本、Y79和Weri1的RB细胞系中的表达并进行比较，将microRNA-143模拟物分别转染到RB细胞系中，并使用逆转录-定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测其对RB细胞系的影响，结果发现microRNA-143的过表达显著降低了细胞活力和RB细胞系的侵袭，并增加了凋亡细胞的数量。Zhang等[23]使用微阵列分析及逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)，以鉴定其与RB进展相关的关键miRNA，发现miR-125a-5p的过表达显著抑制了RB中的细胞增殖和肿瘤形成，进一步研究表明miR-125a-5p作为重要的肿瘤抑制剂起作用，其通过靶向TAZ抑制EGFR途径来抑制RB的进展。Wu等[24]发现，miR-186靶向含有AAA结构域的蛋白2(ATAD2)，通过Hedgehog信号转导途径影响RB的存活力、侵袭、迁移、血管生成和凋亡的能力。Xu等[25]研究表明，miR-340在RB细胞系中低表达，miR-340的上调可以降低RB细胞的增殖并诱导其凋亡，并证明其在RB细胞中的功能至少部分通过下调KIF14实现，有望成为未来RB临床治疗的新方向。因此，这一类为抑癌基因作用的miRNA上调后，通过靶向不同的蛋白基因途径在RB治疗中发挥作用。

3.3.2 miRNA下调在RB靶向治疗方面的应用Huang等[26]在接受眼球摘除术的RB患者的RB组织和从接受眼球摘除术的其他创伤患者收集的正常视网膜组织中检测到miR-182和细胞间黏附分子2(CADM2)的表达水平，结果表明，miRNA-182的下调通过抑制PI3K/AKT途径和CADM2上调来抑制RB中的细胞活力、侵袭和血管生成。Song等[27]研究发现，miRNA-224-3p的下调通过增加大肿瘤抑制因子2(LATS2)激活Hippo-YAP信号通路来阻碍RB的进展。同时，Sun等[28]发现，miRNA-492下调也通过直接靶向LATS2减弱RB中的细胞增殖和侵袭。Gui等[29]研究发现，在Weri-Rb-1细胞中miR-21抑制剂可抑制miR-21的表达和细胞活力，但通过调节PDCD4、Bax和Bcl-2的表达来改善细胞凋亡率。同时，miR-21抑制剂通过抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表达抑制细胞迁移和侵袭，并显著影响PTEN、PI3K和p-AKT的表达。Ding[30]检测了HXO-RB44细胞系人正常视网膜组织和RB组织标本中miR-21的表达，并使用靶向抗miR-21(t-anti-miR-21)的8-mer微小种子研究了其功能，发现t-anti-miR-21在体外显著抑制了RB细胞增殖、迁移和集落形成，具有与抗miR-21相似的作用，证明HXO-RB44细胞中miR-21的敲低能够抑制RB的进展。综上所述，这一类为癌基因作用的miRNA下调后，通过靶向不同的信号途径抑制RB的细胞增殖、侵袭和血管生成等生物学行为，发挥治疗作用。

3.3.3 miRNA在RB治疗药物敏感性方面的应用肿瘤细胞群体具有内在的、高度有序发展的抗药能力[31]，无论是细胞毒类药物还是靶向药物，均未能克服耐药问题[32]，而不少学者提出肿瘤耐药性的发展与miRNA的失调有关[33-34]，miRNA也成为肿瘤耐药研究领域一个热点。miR34a的上调、HMGB1的敲低或自噬的抑制恢复了RB细胞中的化学敏感性并增强了肿瘤细胞的死亡[34]。这些为miRNA调控HMGB1表达的机制及其对自噬和耐药性的可能贡献提供了新的见解[35]。Yang等[36]使用人RB和邻近的肿瘤组织以及人RB细胞系(HXO-Rb44、SO-Rb50、Y79和WERI-RB-1)，使用四种化学治疗药物，包括卡铂(CBP)、依托泊苷(VP-16)、阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)来处理细胞系，以评估RB细胞的药物敏感性，结果表明miR-34a/MAGE-A/p53轴可能有助于提高RB化学治疗的疗效。也有学者研究发现，miR-34a下调，Notch1在HXO-RB44和Y79细胞中上调，此外，Notch1被鉴定为miR-34a的靶基因，其可通过miR-34a的表达增加而下调[37]。证明miR-34a上调和Notch1下调显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡并增强卡铂HXO-RB44和Y79细胞的敏感性。Yuan等[38]利用人RB细胞系(WERI-RB1、SO-RB50和Y79)和人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19，同时构建了耐药细胞SO-RB50/VCR和SO-RB50/CBP，检测RB细胞中miR-515-5p和Notch1的表达，进一步证明过表达的miR-515-5p通过靶向Notch1表达抑制RB细胞的增殖和耐药性增加。Li等[38]采用生物信息学方法预测RB样本及其下游靶基因差异表达的miR-222，通过模拟物或抑制剂改变miR-222的表达，以检查其在响应化学治疗剂VCR在RB细胞中的作用，结果发现miR-222通过靶向von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子促进缺氧诱导因子1α的表达，从而增加RB细胞对化学治疗药物VCR的耐药性。因此，miRNA可提高RB治疗中的药物敏感性。

4 小结

RB严重威胁着患儿的健康和生命，近年来，大量miRNA的研究为RB的病因学研究、诊断和治疗提供了新思路。到目前为止，有关miRNA的调查研究规模均较小，同时考虑到血清及组织样品中miRNA水平存在个体差异，实验的可重复性较低，选择特异的miRNA作为RB新兴的生物学指标及靶向治疗药物，还需要更深入的探索。另外，虽然化学治疗及靶向药物的出现大大提高了RB的治愈率，但是耐药性的发生不仅降低了化学治疗效果，而且阻碍了新药的研发。因此，对miRNA与肿瘤耐药性的研究具有一定的现实意义，也将是未来肿瘤研究领域的热点和难点。